hplc法測(cè)定金銀花提取物中綠原酸的含量 | hplc法測(cè)定金銀花提取物中綠原酸的含量 |
| 發(fā)布時(shí)間:2020-05-31 信息來(lái)源:admin 發(fā)布人:admin 點(diǎn)擊次數(shù):1528 |
建立金銀花提取物中綠原酸含量的hplc測(cè)定方法。 方法國(guó)產(chǎn)c18柱（4.6 mm×250 mm,7 μm）; 流動(dòng)相為乙腈：0.4%磷酸（12∶88）； 檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm； 流速1 ml·min-1； 進(jìn)樣量10 μl；柱溫25℃。 結(jié)果綠原酸在0.071 6～0.644 4 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0.999 6；平均回收率99.99%，rsd=1.61%（n=6）。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可用于金銀花提取物的含量測(cè)定及質(zhì)量控制。 【關(guān)鍵詞】 金銀花提取物； 綠原酸； 高效液相色譜法 determination of chlorogenic acid in the extract of flos lonicerae by hplc liu lei, he zai＇an , yu zichuan, liu chaoying, liu yanwen* (key laboratory of resource science and compound recipe in chinese medicine of ministry of education hubei college of tcm, wuhan 430061，china) abstractobjectiveto establish a method for the determination of chlorogenic acid in the extract of flos lonicerae.methodsthe chromatographic conditions were as follows: c18 chromatographic column (4.6 mm×250 mm,7 μm)，a mobile phase of acetonitrile and 0.4% h3po4(12:88)，the detection wavelength at 327 nm and the flow rate being 1 ml·min-1. resultsa linearity of chlorogenic acid in the extract was obtained in the range of 0.071 6～0.644 4 μg r=0.999 6(n=6).the average recovery was 99.99% and rsd=1.61%(n=6). conclusionthis method is easy, sensitive and accurate for the determination of chlorogenic acid in the extract of flos lonicerae. key wordschlorogenic acid; hplc; determination 金銀花flos lonicerae又名忍冬、雙花 ，為臨床常用中藥 ,具有清熱解毒、涼散風(fēng)熱之功效 ，主治癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒、溫病發(fā)熱等［1］。在中成藥中，金銀花或以細(xì)粉直接入藥，或以提取物的形式入藥，但大部分制劑以后者的形式入藥，但即使以后者入藥，也有兩種形式，一是以全草直接投料,煎煮入藥，即以煎煮液(即藥材的提取液)作為半成品(中間體)；另一種是先提取有效部位，而后以提取物投料，即以提取物作為中間體(原料)（劉艷娥《第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文》）。為了有效控制金銀花提取物（中間體）的內(nèi)在質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)參考了有關(guān)文獻(xiàn)［2，3］及2005版《中國(guó)藥典》［4］方法，采用高效液相色譜法測(cè)定金銀花提取物中綠原酸含量。 1 儀器與試藥 agilent 1100 series 高效液相色譜儀（g1322a排氣閥，g1311a泵，g1316a柱溫箱，g1314a紫外檢測(cè)器），chemistation 色譜工作站，kromasil c18色譜柱，超聲提取器（kq3200de型數(shù)控超聲儀昆山市超聲儀器有限公司）；綠原酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品鑒定所，批號(hào)110753-200212)，金銀花提取物（本實(shí)驗(yàn)室自制）， 乙腈，磷酸均為分析純；水為雙蒸水。 2 方法與結(jié)果［5］ 2.1 分析方法的建立——分離及檢測(cè)條件的選擇 2.1.1 色譜條件 色譜柱為國(guó)產(chǎn)kromasil c18柱（250 mm×4.6 mm，7 μm）； 柱溫25℃; 流動(dòng)相為乙腈-0.4% 磷酸(12∶88)；流速為1 ml·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm。 2.1.2 ph值對(duì)峰形的影響 綠原酸屬于有機(jī)酸類物質(zhì)，在hplc測(cè)定時(shí)易發(fā)生前沿或拖尾峰，流動(dòng)相加入酸可以改善這種現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)比較了水、乙酸、磷酸對(duì)峰形的影響，當(dāng)選用0.4%磷酸時(shí)，可得到較好的色譜峰形。 2.1.3 色譜系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn) 在選定條件下，綠原酸和樣品中其他組分可基線分離，綠原酸與其相鄰色譜峰的分離度大于1.5，理論塔板數(shù)（n）為5 000以上。結(jié)果見(jiàn)圖1。 a-對(duì)照品 b-供試品 圖1 金銀花提取物hplc圖譜 2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取綠原酸對(duì)照品適量，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成每毫升含35.8μg的溶液，即得。2.3 供試品溶液的制備 精密稱取本提取物10 mg，置100 ml容量瓶中，雙蒸水溶解，超聲2 min后，再用雙蒸水定容至刻度，搖勻，過(guò)0.45 μg微孔濾膜，取續(xù)濾液即得。 2.4 線性范圍的考察及其標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取對(duì)照品溶液2， 4，6，10，14，18μl，分別注入液相色譜儀。按上述色譜條件測(cè)定峰面積。以峰面積積分值（a）對(duì)進(jìn)樣量進(jìn)行回歸，得回歸曲線方程：y =2 468.4x - 16.205，r=0.999 6。結(jié)果表明，綠原酸在0.071 6～0.644 4 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。結(jié)果見(jiàn)圖2。 圖2 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線 2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10μl，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄各組綠原酸峰面積值，結(jié)果平均峰面積為：840.5，rsd為0.69%（n=6）。 2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0，2，4，6，8 h進(jìn)樣10μl，測(cè)得綠原酸的平均峰面積值為：680.24，rsd為：0.38%（n=5），表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。 2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批號(hào)（070204）樣品6份，按含量測(cè)定方法測(cè)定，結(jié)果綠原酸平均含量為28.01%，rsd為1.07%（n=6）。 2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的金銀花提取物6份，分別精密添加綠原酸對(duì)照品適量，按供試品溶液的方法制備，測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 2.9 樣品測(cè)定 取3批樣品，按照上述方法制備供試品溶液，進(jìn)樣10μl，依照已確定的色譜條件測(cè)定，按峰面積值用外標(biāo)法計(jì)算樣品中綠原酸的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果 3 討論 金銀花提取物以有機(jī)酸為有效成分，本實(shí)驗(yàn)以綠原酸含量作為金銀花提取物的質(zhì)量控制指標(biāo)，同時(shí)測(cè)定了3批金銀花提取物中綠原酸的含量，通過(guò)計(jì)算，其含量均在20%以上。本文所建立的方法簡(jiǎn)便、快捷，重復(fù)性及穩(wěn)定性均較好，可在實(shí)際生產(chǎn)中用于該提取物的質(zhì)量控制。本文所做的工作為開發(fā)金銀花的相關(guān)產(chǎn)品提供了質(zhì)量監(jiān)控方法。
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