液相色譜法測定亳菊提取物中木犀草素及芹菜素的含量 | 液相色譜法測定亳菊提取物中木犀草素及芹菜素的含量 |
| 發(fā)布時間:2020-05-31 信息來源:admin 發(fā)布人:admin 點擊次數(shù):1529 |
建立同時測定亳菊提取物中木犀草素及芹菜素的反相高效液相色譜檢測方法。方法采用Restek PinnacleⅡC18（250mm×4.6mm,5μm） 色譜柱,配制流動相為甲醇∶四氫呋喃∶0.3%H3PO4水溶液=42∶13∶56,在流速為1.0ml/min,檢測波長為350nm,柱溫為室溫,進樣量為10μl的情況下建立測定方法。 結(jié)果木犀草素線性范圍為3.99-99.75μg/ml（r=0.9996）,平均加樣回收率為105.9%,RSD=1.5%;芹菜素線性范圍為4.095-102.375μg/ml（r=0.9996）,平均加樣回收率為103.7%,RSD=2.5%。 結(jié)論用該方法測定亳菊提取物中木犀草素及芹菜素的含量,具有分析時間較短,分離度高的特點。
【關(guān)鍵詞】 反相高效液相色譜法；木犀草素；芹菜素；亳菊提取物 determination of luteolin and apigenin in chrysanthemum morifolium extract by rp-hplc pan jian, wang xiang, yang yi, jin risheng engineering research center of bio-process of ministry of education，hefei university of technology，hefei 230009，china abstract：objectiveto develop a reversed-phase high performance liquid chromatographic method for the simultaneous determination of luteolin and apigenin in chrysanthemum morifolium extract.methodsthe separation was carried out on a restek pinnacle ⅱ c18 column（250 mm×4.6 mm，5 μm）with meoh∶thf∶0.3%h3po4=42∶13∶56 as mobile phase at a flow rate of 1.0 ml/min.the absorbance was monitored at 350 nm.the volume of injection was 10 μl.resultsthe linearity was good within the ranges of 3.99 μg/ml～99.75 μg/ml（r=0.999 6）for luteolin and 4.095 μg/ml～102.375 μg/ml（r=0.999 6）for apigenin.the average recoveries were 105.9% and 103.7% and the relative standard deviations（rsds）were 1.5% and 2.5% respectively.conclusionthe method used for the determination of luteolin and apigenin in the chrysanthemum morifolium extract has the characteristics of short retention and high resolution. key words：rp-hplc；luteolin；apigenin； chrysanthemum morifolium extract 中藥菊花是菊科植物菊chrysanthemum morifolium ramat.的干燥頭狀花序［1］，是一種常用中藥，具有疏風(fēng)、清熱、明目、解毒功效，臨床上用于治療高血壓病和冠心病等［2］。亳菊主產(chǎn)于安徽亳州、渦陽一帶［3］。菊花的有效部位主要有黃酮類、萜類、碳環(huán)芳香族酚酸類化合物（蔣惠娣．《中藥杭白菊心血管系統(tǒng)作用及活性成分研究》．2004浙江大學(xué)博士學(xué)位論文）［4］。亳菊提取物成分復(fù)雜，為控制其產(chǎn)品質(zhì)量，依據(jù)菊花藥效物質(zhì)及藥理作用，建議以綠原酸、木犀草素、芹菜素和總黃酮4個指標(biāo)，構(gòu)建質(zhì)量評價體系。其中木犀草素具有消炎、抗過敏、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、降低兔實驗性動脈粥樣硬化程度和降膽固醇等作用［4，5］；芹菜素具有抗腫瘤、抗炎、降血壓和舒張血管、抗動脈硬化和血栓癥、抗焦慮、抗菌、抗病毒等作用［6］。兩者藥理作用與亳菊的藥理作用相近，且兩者在亳菊提取物中含量較高。因此，建立同時測定木犀草素及芹菜素的hplc測定方法，對亳菊提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究及亳菊藥材的質(zhì)量控制具有重要的意義。 1 儀器與試藥
waters高效液相系統(tǒng)（包括waters 515泵，waters 2487雙波長紫外檢測器，empower色譜工作站）；sc5202超聲清洗器（上海蒲超超聲波儀器設(shè)備有限公司）；ag135型電子天平（mettler toledo）。 2 方法與結(jié)果 2.1 色譜條件色譜柱為restek pinnacle ⅱ c18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為甲醇∶四氫呋喃∶0.3%h3po4=42∶13∶56；流速1.0 ml/min；檢測波長350 nm；柱溫為室溫；進樣量10 μl。 2.2 對照品儲備液的制備精密稱取木犀草素、芹菜素對照品適量，用甲醇溶解配制成含木犀草素為399 μg/ml及芹菜素為409.5 μg/ml的對照品混合溶液。 2.3 供試品溶液的制備取亳菊提取物樣品約75 mg，精密稱定置小燒杯中，用10 ml甲醇超聲溶解，轉(zhuǎn)移至25 ml容量瓶中并定容搖勻，取部分溶液離心（10 000 r/min，5 min），取上清液即得供試品溶液。 2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制從對照品儲備液中精密量取0.1，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 ml，分別置于10 ml容量瓶中，甲醇定容，得到系列混合對照品溶液，各進樣10 μl，按照上述的色譜條件測定，以峰面積為縱坐標(biāo)，對照品濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得木犀草素回歸方程為y=34 778x-41 681（r=0.999 6），線性范圍為3.99～99.75 μg/ml；芹菜素回歸方程為y=50 871x-38 471（r=0.999 6），線性范圍為4.095～102.375 μg/ml。 2.5 精密度實驗取木犀草素、芹菜素混合對照品溶液（其中木犀草素為99.75 μg/ml，芹菜素為102.375 μg/ml）重復(fù)進樣5次，10 μl/次，測量峰面積，其中木犀草素峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（rsd）為1.93%，芹菜素峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（rsd）為2.07%。 2.6 重復(fù)性實驗按供試品溶液制備方法制備5份供試品溶液，分別進樣10 μl，依照上述選擇的色譜條件測定，結(jié)果木犀草素含量的rsd為1.83%，芹菜素含量的rsd為2.08%。 2.7 穩(wěn)定性實驗按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，分別在0，2，4，6，16 h分別進樣10 μl，依照上述選擇的色譜條件測定，結(jié)果木犀草素峰面積的rsd為2.26%，芹菜素峰面積的rsd為3.03%。 2.8 加樣回收率實驗 2.8.1 木犀草素加樣回收率實驗精密稱取亳菊提取物約20 mg置小燒杯中，加入木犀草素對照品，用5 ml甲醇超聲溶解,轉(zhuǎn)移至10 ml容量瓶中并定容搖勻，取部分溶液離心（10 000 r/min，5 min），取上清液，進樣10 μl，依照上述選擇的色譜條件測定。結(jié)果見表1。表1 亳菊提取物中木犀草素的加樣回收率測定結(jié)果（略） 2.8.2 芹菜素加樣回收率實驗精密稱取亳菊提取物約75 mg置小燒杯中，加入芹菜素對照品，用10 ml甲醇超聲溶解，轉(zhuǎn)移至25 ml容量瓶中并定容搖勻，取部分溶液離心（10 000 r/min，5 min），取上清液，進樣10 μl，依照上述選擇的色譜條件測定。結(jié)果見表2。表2 亳菊提取物中芹菜素的加樣回收率測定結(jié)果（略） 2.9 樣品測定按供試品溶液制備方法制備5份供試品溶液，依照上述選擇的色譜條件，進樣10 μl，木犀草素和芹菜素的保留時間分別在11.3，15.6 min左右。色譜圖見圖1。結(jié)果見表3。表3 亳菊提取物中木犀草素及芹菜素的含量測定（略） 3 討論 3.1 檢測指標(biāo)的確定《中華人民共和國藥典》菊花項下以綠原酸為質(zhì)量控制指標(biāo)，但僅用綠原酸難以反映菊花廣泛的藥理作用。亳菊中黃酮類化合物含量高,對心血管具有多種作用，所以黃酮類化合物含量宜列入質(zhì)量控制指標(biāo)。由于黃酮類成分比較復(fù)雜，一般以測總黃酮為考察指標(biāo)（邢志霞．《懷菊花質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究》．河南中醫(yī)學(xué)院論文集．2006）。有效成分木犀草素及芹菜素是在亳菊中含量較高且藥理作用與菊花相似的黃酮類單體成分，其含量的高低對于亳菊藥材以及亳菊提取物的藥效有著重要影響，所以在亳菊藥材及其提取物質(zhì)量檢查時如同時控制綠原酸、總黃酮、木犀草素及芹菜素的含量則更佳。 3.2 流動相的選擇文獻資料基本是用甲醇磷酸水溶液作為流動相來測定木犀草素，但是在本研究過程中經(jīng)過多次實驗，發(fā)現(xiàn)分離效果對于流動相組成比例和溫度變化很敏感，且分析時間長。多次實驗結(jié)果表明，在等梯度的情況下，只用甲醇磷酸水溶液做流動相同時測定木犀草素及芹菜素，難以使兩者達到較好檢測水平。
木犀草素及芹菜素 98%
上禾生物 0731*84213302
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