連錢草高效液相色譜指紋圖譜研究 | 連錢草高效液相色譜指紋圖譜研究 |
| 發(fā)布時間:2020-05-31 信息來源:admin 發(fā)布人:admin 點擊次數(shù):829 |
建立連錢草高效液相色譜（hplc）指紋圖譜分析方法，為其質(zhì)量控制和藥材鑒別提供依據(jù)。方法利用高效液相色譜法，采用反相symmetry c18柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為乙腈和0.4%磷酸溶液（梯度洗脫）；檢測波長327 nm；柱溫30℃；流速1.0 ml/min。進(jìn)樣體積20 μl。
結(jié)果在選定的色譜條件下確定18個峰構(gòu)成連錢草藥材的指紋特征,各批次藥材均具有上述特征,但特征峰的相對含量分布差異導(dǎo)致色譜概貌存在一定差異。確定了連錢草藥材hplc 中綠原酸、木犀草素二個黃酮成分所對應(yīng)的保留時間一致;10個批次的連錢草藥材hplc 指紋圖譜相似度均大于0.93。結(jié)論該方法準(zhǔn)確、簡單、穩(wěn)定，其色譜指紋圖譜可用于連錢草的鑒別和質(zhì)量控制。
【關(guān)鍵詞】 （江蘇省中醫(yī)藥研究院， 江蘇 南京 210028； 南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210029） study on hplc fingerprint of herba glechomae zhu lingying，qian dawei，duan jinao，qian shihui (jiangsu provincial institute of tcm，nanjing 210028，china；nanjing university of tcm,210029,china ) abstract：objectiveto establish an hplc fingerprint of herba glechomae.methodsthe hplc method was used,and the chromatography conditions were symmetry c18 column(250 mm ×4.6 mm,5μm) with mobile phase of acetonitrile--0.4% phosphoric acid dihydrogen phosphate solution of water ; the uv detection wavelength was 327 nm and column temperature was 30℃with the flow rate of 1.0 ml/min;the injection volume was 20μl. resultsin this chromatography condition,eighteen peaks were identified as the characteristic fingerprints of herba glechomae. all samples tested contained the same eighteen peaks,but the content of each peak showed great difference among the samples,which resulted in the differences in their chromatograms.the retention time of caffeotannic acid and luteolin in herba glechomae were determined. the fingerprint showed high similarity in samples from different habitats. conclusionthe method is exact,simple and accurate, and can be used for the identification and quality control of herba glechomae.
key words：herba glechomae; fingerprint; hplc 1 儀器與材料 1.1 儀器 waters 2695高效液相色譜系統(tǒng)，二極管陣列檢測器，empower色譜工作站，中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004a 版，mettler萬分之一，十萬分之一電子天平，milli-q純水器。 1.2 材料 試劑：dikmapure乙腈為色譜純，甲醇為色譜純（江蘇漢邦科技有限公司），其它試劑均為分析純。對照品：木犀草素由（江蘇省中醫(yī)藥研究院化學(xué)研究室提供）純度達(dá)98%以上；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品由中國生物藥品鑒定所提供；藥材來源：江蘇省盱眙縣。 2 方法 2.1 色譜條件 色譜柱為symmetry c18柱 (4.6 mm×250 mm，5μm)；檢測波長327 nm；柱溫30℃； 流動相為（a）乙腈和（b）0.4%磷酸溶液，（12∶88）梯度洗脫，運行時間90 min。1～70 min乙腈從12%線性梯度至76%；70～75 min線性梯度至12%；75～90 min線性梯度至12%。流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量20 μl。 2.2 對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸，木犀草素對照品適量分別用甲醇溶解稀釋并定容，得對照品溶液,濃度分別為綠原酸45.5 μg/ml，木犀草素0.146 mg/ml，再分別精密吸取1 ml，置5 ml容量瓶中，加甲醇稀釋致刻度，搖勻，作為混合對照品溶液。 2.3 供試品溶液的制備 精密稱取連錢草細(xì)粉約2.5 g置索氏提取器中，加入乙醚100 ml，水浴回流至無色，回收乙醚，將藥渣中乙醚揮干，繼用80 ml甲醇提取至無色，放冷，移至100 ml容量瓶內(nèi)，并用甲醇定容至刻度，搖勻，取上清液經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。 3 結(jié)果 3.1 圖譜測定時間的確定 取樣品溶液20 μl，注入高效液相色譜儀，按選定的梯度洗脫，記錄90 min內(nèi)色譜圖，結(jié)果表明60 min 后無有意義峰出現(xiàn)，故確定圖譜記錄時間90 min。 3.2 精密度實驗 精密稱取連錢草1號樣品細(xì)粉2.5 g，按供試品溶液制備方法制得供試品溶液，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄指紋圖譜。考察各共有峰相對保留時間及相對峰面積比值的一致性，結(jié)果顯示各共有峰相對保留時間rsd為0.01%～0.35%，相對峰面積的rsd為0.36%～2.49%，符合指紋圖譜研究技術(shù)的要求［5］。 3.3 重復(fù)性實驗 精密稱取連錢草2號樣品細(xì)粉6份，按供試品溶液制備方法制得供試品溶液，進(jìn)行測定，考察各共有峰相對保留時間及相對峰面積比值的一致性，各共有峰相對保留時間的rsd為0.01%～0.14%，相對峰面積的rsd為0.28%～2.83%，符合指紋圖譜研究技術(shù)的要求［6］。 3.4 樣品指紋圖譜測定 分別取不同批次連錢草樣品10個，按供試品溶液的制備方法獲得供試溶液，測定，通過10批連錢草樣品的指紋圖譜的測定，比較其色譜圖，確定共有峰18個，相對保留時間、相對峰面積見表1～2。色譜圖結(jié)果見圖1～2（峰4為綠原酸峰，15號峰為木犀草素）。 表1 樣品相對保留時間 （略） 表2 樣品相對峰面積（略） 圖1 連錢草樣品hplc指紋圖譜（略） 圖2 10批連錢草藥材指紋圖譜（略） 3.5 相似度計算 運用國家藥典委員會開發(fā)的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004a 版對10批連錢草藥材的指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，首先將色譜工作站數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥指紋圖譜相似度計算軟件，選定上述18個特征峰進(jìn)行譜峰匹配，通過中位數(shù)矢量計算得出連錢草樣品指紋圖譜的共有模式，并以此共有模式為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行整體相似度評價，相似度評價結(jié)果均大于0.92，說明這10批連錢草藥材的化學(xué)成分一致性較好。結(jié)果見表3。 表3 樣品指紋圖譜相似度分析結(jié)果（略） 4 討論 4.1 提取溶劑與提取方法的選擇 在供試品溶液制備條件選擇上，脫脂溶劑曾采用乙醚、氯仿、等溶劑進(jìn)行脫脂, 以乙醚溶液脫脂效果較好,在提取溶劑選擇上，比較了甲醇、乙醇、丙酮做提取溶劑試驗，結(jié)果表明樣品用甲醇為溶劑，提取比較完全。在提取方法的選擇上，用甲醇作溶劑, 對比回流提取、索氏與超聲提取3種提取方法，三者h(yuǎn)plc圖譜基本一致，但是從主要色譜峰的積分面積和雜質(zhì)干擾上可見索氏提取的效率明顯高于超聲、與回流提取，因此選擇采用索氏提取法。 4.2 流動相的選擇 在流動相的選擇實驗過程中，最初采用的甲醇-水，乙腈-水，乙腈-甲醇-水，乙腈-0.4%磷酸二氫鉀溶液（50∶50）等度流動相未得到滿意的分離效果，然后又選擇了甲醇-0.5%磷酸二氫鉀溶液以及乙腈-0.4%磷酸溶液等多種不同流動相、不同梯度的流動相體系，最終確定以本實驗現(xiàn)在采用的乙腈-0.4%磷酸溶液（12∶88）梯度流動相體系各成分分離效果最佳。 4.3 檢測波長的選擇 本實驗用二極管陣列檢測器，在200～400 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，提取連錢草黃酮苷等的色譜峰光譜圖，在325～341 nm 處有最大吸收，綜合多個成分考慮，故選取327 nm 作為連錢草指紋圖譜的檢測波長，以提高檢測的靈敏度，提高分析方法的準(zhǔn)確性和可靠性。 4.4 共有峰的確定 對不同供試品所得指紋圖譜進(jìn)行分析，選擇穩(wěn)定性較好，吸收強(qiáng)，特征明顯的色譜峰為共有峰共標(biāo)定了18個峰。其中峰4為綠原酸，峰15為木犀草素。木犀草素峰較大，分離度及峰型都很好，因此選擇15號峰為參考峰，計算各特征峰的相對保留時間，和相對峰面積。每批樣品均有18個色譜峰，除已標(biāo)定的色譜峰外，還有一些不太明顯的共有峰及每批樣品各自特有的色譜峰，可作為測定特定類型連錢草的指標(biāo)。 4.5 方法評價 連錢草的化學(xué)成分研究表明其含有豐富的黃酮。本文采用hplc-pda檢測器檢測，優(yōu)化色譜條件，供試液原液過濾后直接進(jìn)樣，建立連錢草藥材中綠原酸、木犀草素的測定方法，目前連錢草的研究多為黃酮苷含量測定,沒有一篇關(guān)于連錢草黃酮苷hplc指紋圖譜的完整研究。本實驗采用綠原酸、木犀草素黃酮苷成分的hplc指紋圖譜進(jìn)行了研究。通過指紋圖譜可以比較全面地反映連錢草藥材的化學(xué)成分以及各特征性有效成分間峰面積的相對比例，進(jìn)而反映連錢草藥材的內(nèi)在質(zhì)量，為連錢草藥材判斷真?zhèn)�、評價優(yōu)劣、考察穩(wěn)定性和一致性提供依據(jù)。本實驗中所建立的測定方法快速準(zhǔn)確，靈敏度高，可作為連錢草質(zhì)量控制和應(yīng)用的依據(jù)以及中藥研究的方法學(xué)借鑒。
木犀草素98% 0731*84213302 上禾生物
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