芹菜素對(duì)慢性間歇低氧幼鼠認(rèn)知損害的保護(hù)作用 | 芹菜素對(duì)慢性間歇低氧幼鼠認(rèn)知損害的保護(hù)作用 |
| 發(fā)布時(shí)間:2020-05-31 信息來源:admin 發(fā)布人:admin 點(diǎn)擊次數(shù):796 |
研究芹菜素對(duì)慢性間歇低氧幼鼠認(rèn)知損害的保護(hù)作用。
方法:八臂迷宮訓(xùn)練成功的3～4周齡雄性sd幼鼠40只，隨機(jī)分空氣對(duì)照組(c組)、間歇低氧組(h組)、間歇低氧二甲基亞砜組(r組)、間歇低氧芹菜素+二甲基亞砜組(q組)。間歇低氧2周后八臂迷宮測(cè)試全部幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力。以透射電鏡觀察海馬ca1區(qū)神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果:與r組比，q組參考記憶錯(cuò)誤(rme)和總記憶錯(cuò)誤(te)顯著降低(p＜0.05，p＜0.01)。與c組比，h組rme、工作記憶錯(cuò)誤(wme)和te顯著增高(p＜0.01，p＜0.05，p＜0.01)。電鏡下h組和r組海馬ca1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)、胞漿內(nèi)的細(xì)胞器與正常細(xì)胞比較有明顯變化，q組和c組無明顯變化。
結(jié)論:芹菜素對(duì)于慢性間歇低氧幼鼠海馬神經(jīng)元具有保護(hù)作用，從而減輕慢性間歇低氧對(duì)幼鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的損傷。 【關(guān)鍵詞】 慢性間歇低氧 芹菜素 記憶 海馬 超微結(jié)構(gòu) protective function of apigenin on the damage of congnition in immatcore rats with chronic intermittent hypoxia. zhang cun-xue, cai xiao-hong, cao shu-yan，zhou yong-hai. department of respiratory medicine，yuying childrens hospital affiliated to wenzhou medical college, wenzhou, 325027. abstract: objective: to explore the protective effect of apigenin in immature rats treated with chronic intermittent hypoxia. methods: forty 3～4 week-old sd rats which have been trained to complete the 8-arm (4-arm baited) radial maze were randomly divided into air control(c) group, intermittent hypoxia(h) group, dmso control(r) group and apigenin + dmso(q) group. after 2 weeks intermittent hypoxia, these immature rats were tested by 8-arm (4-arm baited) radial maze to measure spatial memory and the ultrastructure of hippocampal cal neurons was studied under electron microscope. results: compared with r group, q group had significantly less in reference memory error and total memory error (p＜0.05, p＜0.01).compared with c group, h group had significantly reference，working and total memory error, respectively（p＜0.01, p＜0.05, p＜0.01).the nuclear membrane of hippocampal cal neurons in h group and r group were distorted compared with normal cells; q group and c group had no changes. conclusion: apigenin protects hippocampal neuron in immature rats, and improves spatial learning and memory damaged by chronic intermittent hypoxia. key words: chronic intermittent hypoxia; apigenin; memory; hippocampus; ultrastructure 芹菜素是天然存在的一種黃酮類化合物，有研究顯示芹菜素對(duì)氧自由基、no自由基等均有一定的清除作用，可抑制導(dǎo)致細(xì)胞死亡的氧化作用,從而體現(xiàn)了神經(jīng)保護(hù)的作用[1]。但其應(yīng)用于防治阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(osahs)兒童認(rèn)知損害方面的報(bào)道較少。本試驗(yàn)?zāi)Mosahs的病理生理基礎(chǔ)，建立慢性間歇低氧的幼鼠模型，并用芹菜素進(jìn)行干預(yù)，采用八臂迷宮測(cè)試其學(xué)習(xí)記憶能力，以透射電鏡觀察海馬的神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，觀察芹菜素干預(yù)慢性間歇低氧幼鼠認(rèn)知損害的效果并探討可能的作用機(jī)制。 1 材料和方法 1.1 動(dòng)物與藥品 取體重為80～100 g健康雄性spf級(jí)sd幼鼠(3～4周齡)50只，由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：syxk(浙)2005-0061。芹菜素純度98%，批號(hào)：060313（購自陜西慧科植物開發(fā)有限公司）；二甲基亞砜批號(hào)：040602（購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）。芹菜素配制方法：25 mg芹菜素+8 ml生理鹽水+40μl dmso，配成11.6×10-3μmol/l，于4 ℃冰箱保存；溶劑配制方法：8 ml生理鹽水+40μl dmso，配成0.5%的溶劑，4 ℃冰箱保存。 1.2 儀器 cyes-ⅱ型氧、二氧化碳?xì)怏w測(cè)定儀由上海嘉定學(xué)聯(lián)儀表廠提供；間歇低氧艙和空氣模擬對(duì)照艙自制（主體由不銹鋼制成，艙蓋中間部分為玻璃；氣體鋼瓶、減壓閥、流量計(jì)、控制程序、繼電器、電磁閥、顯示器等組成控制系統(tǒng),間歇低氧艙125 cm×48 cm×24 cm大小，側(cè)壁上有4個(gè)進(jìn)氣的單向閥，4個(gè)排氣的單向閥，空氣模擬對(duì)照艙大小60 cm×48 cm×24 cm大小，側(cè)壁上有2個(gè)進(jìn)氣的單向閥，2個(gè)排氣的單向閥），電磁閥由寧波亞德客自動(dòng)化工業(yè)有限公司提供，單片機(jī)選用臺(tái)灣華邦（winbond）的w78e516b八位單片機(jī)，醫(yī)用壓縮氧氣(濃度>99.5%)和壓縮高純度氮?dú)?濃度>99.99%)由溫州市醫(yī)用氧廠提供；lkb2088型超薄切片機(jī)、h-7500型透射電鏡由日本日立公司提供，八臂迷宮由溫州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院麻醉科自制，迷宮距地面高40 cm，中間八邊形平臺(tái)直徑30 cm，向四周以等角度和等長度延伸八條臂(50 cm×12 cm，圍以40 cm高的墻，在每個(gè)臂的頂端有一個(gè)強(qiáng)化用的食物杯，直徑2 cm，深1 cm)；迷宮用飼餌由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室提供。 1.3 八臂迷宮試驗(yàn) 在放迷宮的房間四周安放一些明顯的視覺標(biāo)志。訓(xùn)練前先將50只幼鼠餓至原體重的85%左右，訓(xùn)練時(shí)早晚各給2粒和3粒飼料，在訓(xùn)練過程中保持該體重。然后在迷宮中適應(yīng)2 d，每天訓(xùn)練一次，適應(yīng)時(shí)2只幼鼠同時(shí)置于迷宮中，自由活動(dòng)和攝取飼餌15 min。每次八臂迷宮的試驗(yàn)時(shí)間控制在5 min內(nèi)，如果超出5 min當(dāng)作訓(xùn)練不成功，第二天接著訓(xùn)練，每天訓(xùn)練2次，如果在10 d內(nèi)還不行達(dá)到訓(xùn)練成功的標(biāo)準(zhǔn)，就淘汰出試驗(yàn)組。本實(shí)驗(yàn)參照huang yw等[2]方法進(jìn)行訓(xùn)練。連續(xù)5次訓(xùn)練錯(cuò)誤選擇次數(shù)為1次或1次以下，同時(shí)wme必須為零，認(rèn)為訓(xùn)練成功，10 d后成功40只。 1.4 動(dòng)物模型建立及分組 參照mcguire m、gozal d等[3，4]方法建立慢性osahs動(dòng)物模型。取迷宮訓(xùn)練成功幼鼠40只，隨機(jī)分為c組、h組、r組和q組，每組各10只。h、r、q組置于常壓間歇低氧艙內(nèi)。90 s為一次低氧-復(fù)氧循環(huán)，以0.3 kpa壓力通氮?dú)?0 s、停30 s，25 l/min流量通氧氣12 s、停18 s，在停止通氣階段由連接的測(cè)氧儀分別測(cè)間歇低氧艙內(nèi)的氧濃度高值、低值和二氧化碳濃度。低氧時(shí)氧濃度控制在7.8%左右，復(fù)氧時(shí)氧濃度控制在21.0%左右，co2濃度始終<0.01%，濕度為（50±10）%。每天7.5 h(8:50～16:20)。c組幼鼠置于同等條件下的空氣模擬對(duì)照艙，通壓縮空氣，與間歇低氧艙由同一單片機(jī)程。q組幼鼠每天于常壓低氧前30 min腹腔注射25 mg/kg[5]用二甲基亞砜溶解的芹菜素（這個(gè)劑量不會(huì)影響幼鼠一般的活動(dòng)能力，可以更客觀地評(píng)價(jià)該藥對(duì)幼鼠運(yùn)動(dòng)行為的影響）。r組則注射同量二甲基亞砜+生理鹽水。幼鼠自由活動(dòng)，不限飲食，實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2周。 實(shí)驗(yàn)過程中，白天各艙上面均蓋厚布，使艙內(nèi)保持黑暗，模擬黑夜，幼鼠進(jìn)入睡眠狀態(tài)。每天間歇低氧結(jié)束后，幼鼠出艙，置于日光燈下，模擬白天，自由活動(dòng)，飲食不限。試驗(yàn)結(jié)束前使幼鼠保持饑餓狀態(tài)，低氧結(jié)束當(dāng)日迷宮測(cè)試，整個(gè)測(cè)定過程同訓(xùn)練過程一致。 1.5 標(biāo)本制備 低氧結(jié)束次日，予戊巴比妥鈉(35 mg/kg體重，i.p.)麻醉，每組隨機(jī)取1只幼鼠，仰臥固定，剖開胸腔，暴露心臟。將吸有預(yù)冷至0～4 ℃生理鹽水的針管刺入左心室，剖開右心耳排液，快速灌入100 ml左右的生理鹽水, 再用200 ml左右預(yù)冷為0～4 ℃的4%戊二醛緩慢灌注后迅速取腦，以常規(guī)電鏡程序制作標(biāo)本，2.5%戊二醛前固定，1%鋨酸后固定，epon812包埋，lkb2088型超薄切片機(jī)切片，經(jīng)鉛-鈾雙重染色，h-7500型透射電鏡觀察。 1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用單因素方差分析，方差齊者組間比較用lsd-t檢驗(yàn)，方差不齊者用tamhanes t2檢驗(yàn) 2 結(jié)果 2.1 芹菜素對(duì)慢性間歇低氧幼鼠認(rèn)知損害的影響 與r組比，q組rme和te顯著降低(p＜0.05，p＜0.01)；與c組比，h組rme、wme和te顯著增高(p＜0.01，p＜0.05，p＜0.01)；q組和c組、h組和r組比較，rme、wme和te差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均p＞0.05）。見表1。 2.2 海馬ca1區(qū)超微結(jié)構(gòu) 透射電鏡觀察，h組神經(jīng)細(xì)胞核膜變模糊、深染、輕度固縮，出現(xiàn)超微結(jié)構(gòu)改變；而c組具有正常的神經(jīng)元、核膜清晰，沒有明顯改變；r組核膜模糊、邊界不清，胞質(zhì)無改變，染色質(zhì)顏色變深；而q組神經(jīng)元、核膜基本正常（見圖1）。 3 討論 芹菜素是天然存在的一種黃酮類化合物，有“植物雌激素”之稱，廣泛存在于多種水果、蔬菜、豆類和茶葉中。研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素有神經(jīng)保護(hù)、抗氧化、清除自由基、抗腫瘤等廣泛的藥理作用。patil cs等[6]研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素能改善衰老和脂多糖導(dǎo)致的認(rèn)知損害。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用放射狀八臂迷宮測(cè)定幼鼠空間記憶能力發(fā)現(xiàn)：芹菜素可避免慢性間歇低氧導(dǎo)致的幼鼠空間學(xué)習(xí)記憶損害，具有重要的神經(jīng)元保護(hù)作用。慢性間歇低氧類似缺血再灌注損傷，導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激，使得活性氧（ros）過量生成，引發(fā)線粒體介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡[7]。我們運(yùn)用透射電鏡觀察到間歇低氧組和溶劑對(duì)照組海馬ca1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞核出現(xiàn)超微結(jié)構(gòu)改變。袁穎等[8]發(fā)現(xiàn)低氧-復(fù)氧后凋亡海馬神經(jīng)元百分率明顯增多。芹菜素是一種很強(qiáng)的金屬離子螯合劑，它可以通過螯合作用降低金屬離子參與的自由基反應(yīng)，減少氧自由基的生成，并對(duì)氧自由基、no自由基等有一定的清除作用，從而能減少氧化應(yīng)激損傷。sugihara n等[9]研究證實(shí)芹菜素對(duì)鐵依賴脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有明顯的抑制作用。singh jp等[10]連續(xù)2周給大鼠注射25 mg/kg劑量的芹菜素，發(fā)現(xiàn)體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物（lpo）水平接近正常水平，從而阻斷致癌物所致的氧化應(yīng)激。本研究發(fā)現(xiàn)芹菜素組海馬超微結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯改變，因此，我們推測(cè)芹菜素對(duì)海馬ca1區(qū)神經(jīng)元的保護(hù)作用可能與其對(duì)自由基的清除、抑制氧化應(yīng)激有關(guān)。
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