厚樸超臨界CO2提取工藝優(yōu)化及提取物抗氧化活性研究 | 厚樸超臨界CO2提取工藝優(yōu)化及提取物抗氧化活性研究 |
| 發(fā)布時(shí)間:2020-07-26 信息來源:admin 發(fā)布人:admin 點(diǎn)擊次數(shù):1779 |
摘 要：目的 優(yōu)選超臨界CO2提取厚樸有效成分的工藝并探討厚樸超臨界CO2提取物的抗氧化活性。方法 采用HPLC法測(cè)定厚樸超臨界CO2提取物中厚樸酚與和厚樸酚的含量，正交試驗(yàn)優(yōu)選厚樸超臨界CO2提取工藝，MTT法檢測(cè)提取物抗氧化活性。結(jié)果 厚樸酚優(yōu)化工藝為萃取壓力25MPa，萃取溫度55 ℃，CO2用量30 kg；和厚樸酚最佳提取工藝壓力15 MPa、萃取溫度50 ℃、CO2用量25 kg。厚樸超臨界CO2提取物具有抗氧化活性，且分離參數(shù)不同，抗氧化活性有顯著差異。結(jié)論 在所優(yōu)選的提取工藝條件下，厚樸酚、和厚樸酚的提取效率較高，重復(fù)性較好，工藝穩(wěn)定可行，提取物具有良好的抗氧化活性。
摘 要：目的 優(yōu)選超臨界CO2提取厚樸有效成分的工藝并探討厚樸超臨界CO2提取物的抗氧化活性。方法 采用HPLC法測(cè)定厚樸超臨界CO2提取物中厚樸酚與和厚樸酚的含量，正交試驗(yàn)優(yōu)選厚樸超臨界CO2提取工藝，MTT法檢測(cè)提取物抗氧化活性。結(jié)果 厚樸酚優(yōu)化工藝為萃取壓力25MPa，萃取溫度55 ℃，CO2用量30 kg；和厚樸酚最佳提取工藝壓力15 MPa、萃取溫度50 ℃、CO2用量25 kg。厚樸超臨界CO2提取物具有抗氧化活性，且分離參數(shù)不同，抗氧化活性有顯著差異。結(jié)論 在所優(yōu)選的提取工藝條件下，厚樸酚、和厚樸酚的提取效率較高，重復(fù)性較好，工藝穩(wěn)定可行，提取物具有良好的抗氧化活性。
厚樸首見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為木蘭科木蘭屬植物厚樸Magnolia officinalis Rehd. et Wils.或凹葉厚樸M. officinalis Rehd. et Wils. var. bilobaRehd. et Wils. 的干燥干皮、根皮及枝皮[1]，主要分布在我國長江流域[2]，為國家二級(jí)保護(hù)植物，是我國特有的、常見的大宗中藥材[3]。厚樸性溫，味苦、辛，入脾、胃、肺、大腸經(jīng)，具有燥濕消痰、下氣除滿的功能[4]，用于濕阻脾胃、脘腹脹滿、氣滯胸腹脹痛、便秘腹脹、痰多咳嗽等癥[5]。現(xiàn)代研究表明，厚樸的化學(xué)成分主要有木脂素類、揮發(fā)油類、生物堿類[6]，木脂素類成分是厚樸中最豐富的一類化學(xué)成分[7]，迄今已分離出厚樸酚、和厚樸酚、和厚樸新酚、6′-O-甲基和厚樸酚等20多種化合物[8]，其主要有效活性成分為厚樸酚及和厚樸酚，厚樸酚具有抗炎、抗菌、抗哮喘、抗?jié)儭⒖寡趸�、抗腫瘤、激素調(diào)節(jié)等藥理作用[9-12]，還可用于糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、胃腸道疾病的治療；和厚樸酚具有抗白內(nèi)障、抗血管新生、抗腫瘤、抗驚厥、抗癲癇、神經(jīng)保護(hù)、抗菌等作用[10-11]，也可用于心血管疾病及糖尿病的治療。 厚樸的常規(guī)提取方法多采用乙醇回流提取、堿提、超聲輔助提取等[13-14]。隨著提取技術(shù)的創(chuàng)新與發(fā)展，超臨界流體萃取作為一種新型分離技術(shù)，其具有高效且選擇性好[15-17]、較低溫度下提取對(duì)熱敏性物料影響小、對(duì)易氧化成分的影響小[18]等一系列優(yōu)點(diǎn)，特別對(duì)于含氧化合物、生物堿等成分提取分離效果好[19]，可在很大程度上避免傳統(tǒng)提取工藝效率低、有機(jī)溶劑殘留、資源浪費(fèi)等缺陷。已有研究表明超臨界流體萃取厚樸成分的效率是傳統(tǒng)醇回流法的數(shù)倍之多[20]。同時(shí)厚樸酚與和厚樸酚二者互為異構(gòu)體，均為脂溶性成分，適合采用超臨界CO2萃取，本實(shí)驗(yàn)嘗試優(yōu)化厚樸超臨界CO2提取工藝，并探討其提取物的體外抗氧化活性，以期為厚樸資源的合理利用奠定基礎(chǔ)。 1 儀器與試藥 1.1 儀器 HL-CQE3L/50MPa-IIC型超臨界CO2萃取裝置，杭州華黎泵業(yè)有限公司；2200型中藥材粉碎機(jī)，常州五谷農(nóng)場(chǎng)食品有限公司；SPD-16高效液相色譜儀，紫外-可見檢測(cè)器，島津儀器有限公司；UV-9100型紫外分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器公司；SB-5200 DTD超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；New Classic MF天平，Mettler Toledo公司；DGF-4AB型立式電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；EKUP-II-20T型超純水系統(tǒng)，長沙市科臨電子科技有限公司；SHEL-LAB CO2培養(yǎng)箱，美國Sheldon Manufacturing公司；Varioskan Flash酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，美國Thermo Scientific公司；Microfuge 20R高速冷凍離心機(jī)，德國Beckman Coulter公司。 1.2 試藥 厚樸飲片購自湖南福泰中藥飲片有限公司，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)劉塔斯教授鑒定為木蘭科木蘭屬植物凹葉厚樸Magnolia officinalis Rehd. etWils. var. biloba Rehd. et Wils.(MOB) 的干燥干皮、根皮及 枝皮。對(duì)照品厚樸酚（批號(hào)KS0912CB14）、和厚樸酚（批號(hào)28O6B5149），質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%，上海源葉生物科技有限公司；MTT，批號(hào)M2128，美國Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)基，AB216498，美國Hyclone公司；30%的過氧化氫溶液，批號(hào)F1825154，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二甲基亞砜為分析純；甲醇為進(jìn)口色譜純，Tedia公司；蒸餾水為二次重蒸餾水；其他試劑均為分析純。 2 方法與結(jié)果 2.1 色譜條件 色譜柱為Diamonsil® C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-水（70∶30）；檢測(cè)波長294 nm；柱溫30 ℃；體積流量1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；在此色譜條件下，厚樸酚、和厚樸酚分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按厚樸酚峰計(jì)算不低于3 800。 2.2 對(duì)照品及供試品溶液的制備 2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取厚樸酚對(duì)照品2.01 mg、和厚樸酚對(duì)照品2.32 mg，分別置于25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成含厚樸酚80.40 μg/mL與和厚樸酚92.80 μg/mL混合對(duì)照品溶液。 2.2.2 供試品溶液的制備 厚樸飲片粉碎，過40目篩，置于60 ℃的烘箱中烘干后裝入料筒，置入超臨界CO2萃取裝置進(jìn)行提取，收集分離釜1和2的提取物并均勻混合，精密稱取提取物適量，置于25 mL量瓶中，加甲醇使之溶解并稀釋至刻度，超聲5 min，靜置，過0.45 μm的微孔濾膜，即得供試品溶液。 2.3 HPLC分析方法學(xué)考察 2.3.1 色譜條件的選擇 分別采用甲醇-水的不同配比（78∶22、70∶30、65∶35）進(jìn)行篩選，在甲醇-水（70∶30）的流動(dòng)相比例下目標(biāo)峰不受其他雜質(zhì)峰的干擾，峰形對(duì)稱。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定厚樸酚對(duì)照品的吸光度，確定檢測(cè)波長294 nm。在上述色譜條件下，和厚樸酚、厚樸酚分離良好，保留時(shí)間分別為8.4、11.2 min。
2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密吸取厚樸酚與和厚樸酚對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL置于5 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，制成不同質(zhì)量濃度梯度的系列對(duì)照品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣10 μL測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，厚樸酚的線性回歸方程分別為Y＝12 554.8 X＋30 696.6，r＝0.999 3；和厚樸酚為Y＝16 703.9 X＋70 459.8，r＝0.999 1；結(jié)果表明，厚樸酚與和厚樸酚進(jìn)樣質(zhì)量濃度分別在8.04～80.4 μg/mL和9.28～92.8 μg/mL與峰面積呈良好的線性關(guān)系。 2.3.3 精密度試驗(yàn) 分別取厚樸酚、和厚樸酚對(duì)照品溶液各10 μL，依法連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果厚樸酚與和厚樸酚峰面積的RSD分別為2.41%和1.86%，表明儀器精密度良好。 2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取厚樸飲片按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行配制6份，進(jìn)樣測(cè)定樣品中厚樸酚與和厚樸酚的含量，結(jié)果表明厚樸酚與和厚樸酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為2.62%、2.78%，說明所建立的分析方法重復(fù)性較好。 2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.3.4”項(xiàng)重復(fù)性試驗(yàn)1號(hào)供試品溶液，分別于0、2、4、6、12、24 h時(shí)測(cè)定峰面積。結(jié)果厚樸酚、和厚樸酚峰面積的RSD分別為1.63%和2.13%，表明所配制的供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。 2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取6份已測(cè)定厚樸酚與和厚樸酚含量的厚樸粗提取物，置于5 mL量瓶中，每份精密加入取厚樸酚與和厚樸酚對(duì)照品溶液各1 mL，加甲醇至近刻度線，搖勻，超聲30 min，放冷后定容至刻度線，微孔濾膜濾過。按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，分別計(jì)算加樣回收率，結(jié)果厚樸酚與和厚樸酚的平均加樣回收率分別為99.15%、99.07%，RSD分別為2.06%、3.10%。 2.4 正交試驗(yàn) 2.4.1 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析 超臨界流體萃取過程受多種因素影響，如萃取目標(biāo)成分本身性質(zhì)、超臨界流體的狀態(tài)、溶劑用量、提取時(shí)間等。作為連續(xù)流加溶劑的萃取過程，超臨界CO2萃取過程溫度低且在CO2保護(hù)下進(jìn)行，可有效降低目標(biāo)組分的氧化破壞和組分之間的化學(xué)反應(yīng)，而提取過程中提取時(shí)間受CO2體積流量的影響很大，但因萃取過程中CO2的狀態(tài)不斷改變，故提取過程中CO2體積流量并不穩(wěn)定，因此以CO2用量作為一個(gè)考察因素。根據(jù)前期試驗(yàn)初步篩選結(jié)果選擇萃取壓力（A）、萃取溫度（B）、CO2用量（C）3因素，選用L9(34)因素水平表進(jìn)行正交試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)號(hào)平行2次，取平均值。以厚樸粗提取率（Y1，Y1＝提取物質(zhì)量/厚樸量）、厚樸酚提取量（Y2，Y2＝提取物中厚樸酚質(zhì)量/厚樸量）、和厚樸酚提取量（Y3，Y3＝提取物中和厚樸酚質(zhì)量/厚樸量）、厚樸酚與和厚樸酚總提取量（Y4，Y4＝Y2＋Y3）為評(píng)價(jià)指標(biāo)。 對(duì)于厚樸粗提取率及以厚樸酚提取量為優(yōu)化目標(biāo)的優(yōu)化工藝均為A3B3C2，即萃取壓力25 MPa，萃取溫度55 ℃，CO2用量30 kg，其中壓力對(duì)其影響最大，溫度影響最小。壓力越大，超臨界流體的密度越大，則溶解能力越強(qiáng)，溫度越高，超臨界流體的黏度降低，則擴(kuò)散能力越強(qiáng)，這符合超臨界CO2萃取的基本規(guī)律，但考慮到生產(chǎn)成本、工業(yè)化生產(chǎn)的實(shí)施以及對(duì)藥材中熱敏性物料的保護(hù)等問題，未繼續(xù)考察進(jìn)一步升高壓力和溫度所帶來的影響，以A3B3C2為優(yōu)化提取工藝。
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