杜仲大蒜復(fù)方添加劑對草魚免疫力的影響 | 杜仲大蒜復(fù)方添加劑對草魚免疫力的影響 |
| 發(fā)布時間:2010-07-02 信息來源:admin 發(fā)布人:admin 點擊次數(shù):3869 |
杜仲大蒜復(fù)方添加劑對草魚免疫力的影響 羅慶華1 ,2 , 賀建華2 , 劉清波1 , 胡超英1 ( 1 . 吉首大學(xué)城鄉(xiāng)資源與規(guī)劃學(xué)院, 湖南張家界427000 ;2 . 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院, 湖南長沙410128) 摘要 [ 目的] 探究杜仲提取物與大蒜素復(fù)方作為飼料添加劑對魚類免疫力的影響, 為該復(fù)方制劑作為抗病促生長的飼料添加劑在漁業(yè)生產(chǎn)中使用提供依據(jù)。[ 方法] 分別用含0 .08% 杜仲提取物、0 .08 % 大蒜素、0 .04% 、0 .08% 、0 .12 % 杜仲大蒜復(fù)方制劑的飼料添加劑的飼料飼養(yǎng)草魚50 d 后, 測定各組草魚的生長速度及熒光假單胞菌活菌攻毒后的免疫保護(hù)力, 并測定草魚血液中白細(xì)胞的吞噬活性及血清中的凝集抗體效價。[ 結(jié)果] 結(jié)果表明: 飼料中添加杜仲提取物、大蒜素和復(fù)方制劑均能明顯提高草魚的免疫應(yīng)答水平, 增強抗細(xì)菌感染能力, 促進(jìn)草魚的生長; 適量添加杜仲大蒜復(fù)方制劑對于提高草魚的免疫力較單方具有協(xié)同增效作用。[ 結(jié)論] 該研究為研制微量高效的魚類用復(fù)方中草藥飼料添加劑奠定了基礎(chǔ)。 關(guān)鍵詞 杜仲提取物; 大蒜素; 草魚; 免疫力; 復(fù)方添加劑 中圖分類號S942 .1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼A 文章編號0517 - 6611(2007) 28 - 08910 - 02 Effects of Compound Additive of Eucommia ul moides Extract and Allium satizrum on Immunity of Grass Carp LUO Qing- hua et al ( College of Resource and Planning Sciences , Jishou University , Zhangjiajie , Hunan 427000) Abstract The purpose of the paper was to determine the effect of the combined additive of Eucommia ulmoides extract , and Alliumsatizrumonthe i mmunity of Grass carp , and provide basis for its application on fishery . 0 .1 % Eucommia ul moides extract , 0 .1 % Alliumsatizrumand 0 .05% ,0 .1% ,0 .15% combination of Eucommia ulmoides extract and Alliumsatizrum were addedto Grass carp‘s diet and fed themfor 50 days . The growth performance of grass carps and the relative percent survived after challenged withlive Pathogenic Bacteria ( P . fluorescens) were measured . The agglutinating antibody tiers and phagocytic activities of leucocytes intheir blood were measured . The results showed Eucommia ul moides extract , Alliumsatizrumandtheir combination could promote their i mmunoresponse level and growth, strengthens their resistance against bacteria . There were synergistic effects between Eucommia ulmoi des extract and Alli umsatizrum whenthey were combined together and added with 0 .04% ～0 .08% . Key words Eucommia ulmoides ; Alliumsatizrum; Grass carp ; Immunity ; Compound additive 杜 仲( Eucommi a ul moedes Oliver) 是傳統(tǒng)名貴中藥, 具補肝腎、強筋骨、抗腫瘤、消炎殺菌等諸多功效[ 1] 。由于資源豐富, 效用良好, 現(xiàn)有將其作為飼料添加劑的相關(guān)報道[ 2] 。筆者對于杜仲在水產(chǎn)養(yǎng)殖的應(yīng)用也作了一些探索, 發(fā)現(xiàn)杜仲作為鯉魚飼料添加劑也有良好的效用[ 3 - 4] 。大蒜素是大蒜( Alli umsativum) 提取液中主要生物活性成分的總稱, 可人工合成。它是一種廣譜抗菌藥, 具有消炎、降壓、降血脂、抑制血小板凝集、減少冠狀動脈硬化、抑制體內(nèi)N- 亞硝胺合成、防治癌癥、健胃、抗病毒等多種功效[ 5] 。大蒜素現(xiàn)被廣泛用于養(yǎng)禽、養(yǎng)畜、水產(chǎn)養(yǎng)殖[ 6] 。國內(nèi)外對杜仲、大蒜在水產(chǎn)養(yǎng)殖的應(yīng)用研究都局限在單方制劑。筆者在中草藥的抑菌試驗中發(fā)現(xiàn)杜仲與大蒜有協(xié)同抑菌作用[ 7] 。該試驗研究了杜仲大蒜復(fù)方飼料添加劑對草魚免疫力的影響, 為研制“微量、高效”的魚類用復(fù)方中草藥飼料添加劑奠定了基礎(chǔ)。 1 材料與方法 1 .1 材料 1 .1 .1 供試草魚。購自張家界市永定魚苗場。選擇體重約35 g 的健康草魚540 尾, 分6 組, 飼養(yǎng)于面積2 m2 、水深0 .5 m的水池中。每組設(shè)3 個重復(fù), 每個重復(fù)30 尾。 1 .1.2 添 加劑與日糧。杜仲提取物( 綠原酸含量10 % 以上) 由張家界市恒興生物公司提供; 大蒜素( 大蒜油含量10% 以上) 由晶天科技實業(yè)公司提供; 杜仲大蒜復(fù)方制劑由杜仲提取物與大蒜素1∶1 混合而成。根據(jù)產(chǎn)品說明與文獻(xiàn)[ 8] 的報 道, 確定添加劑量。對照1 組不添加添加劑, 對照2 、3 組分別單獨添加杜仲提取物或大蒜素, 試驗組添加復(fù)方制劑。各組投喂飼料的配方見表1 , 其營養(yǎng)指標(biāo)見表2 。
1 .1 .3 供試菌。熒光假單胞菌( P . fluorescens ) 56- 12-10 菌株購自中國科學(xué)院水生生物研究所, 金黃色葡萄球菌( St aphyl ococcusaureus) 25922 菌株購自中國科學(xué)院菌種所。 1 .2 方法 1 .2 .1 飼 養(yǎng)管理。按表1 配方配制配合飼料,“四定”投餌,水溫13 ～20 ℃, 投餌率1 % ～2% 。 1 .2 .2 成活率與生長速度的測定。記錄各組草魚死亡數(shù)量,分析原因, 統(tǒng)計各個處理的成活率。分組稱取各組魚的初重和飼養(yǎng)50 d 后的重量, 計算各組魚的尾均增重與相對生長率。 1 .2.3 攻 毒試驗。飼養(yǎng)50 d 后, 從試驗組與對照組隨機撈取安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),Journal of Anhui Agri .Sci .2007 ,35(28) :8910 - 8911 ,8932 責(zé)任編輯劉月娟責(zé)任校對俞潔草魚30 尾( 每個重復(fù)組10 尾) , 用細(xì)金屬絲在草魚身體表面劃痕, 再用熒光假單胞菌9 ×106 個/ ml 的活菌液浸泡草魚30min。繼續(xù)飼養(yǎng)觀察2 周, 記錄發(fā)病癥狀、死亡情況, 對死亡魚體進(jìn)行解剖檢查、分離細(xì)菌、確認(rèn)死因, 計算免疫保護(hù)力( RPS) [ 8] 。 1 .2.4 免 疫。用滅菌生理鹽水洗下已培養(yǎng)好的平板熒光假單胞菌菌苔, 制取菌液, 采用麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)整菌液含量至9 ×108 個/ ml , 加5 % 福爾馬林滅活作為免疫原( Formalin Killed P . fl uorescens ,F- PF) , 加水稀釋10 倍后, 分別將各組30 尾草魚( 每個重復(fù)組10 尾) 浸泡1 h,7 d 后重復(fù)1 次。 1 .2 .5 凝集抗體效價的測定。距第1 次浸泡后21 和28 d 后,分別從上述草魚中取10 尾, 從腹主動脈抽取血液, 待凝血后取血清。采用血凝板法測定凝集抗體效價, 反應(yīng)抗原為F- PF[ 9] 。 1 .2 .6 白細(xì)胞吞噬活性的測定。在第28 天抽取血液時, 從中取1 份加肝素鈉抗凝, 在0 .5 ml 抗凝血中加入金黃色葡萄球菌( 9 ×108 個/ ml ) 0 .2 ml , 置于培養(yǎng)箱( 25 ℃) 中培養(yǎng)1 h, 后于離心機內(nèi)3 000 r/ min 離心15 min。取沉淀底層物抹片, 待風(fēng)干后用甲醇固定, 姬母薩氏染色, 鏡檢。并且, 計算白細(xì)胞的吞噬百分比( PP) 與吞噬指數(shù)( PI) [ 10] 。 2 結(jié)果與分析 2 .1 草魚的成活率與生長速度由表3 可知, 經(jīng)卡方檢驗,各組間成活率不存在明顯差異。試驗組與對照組的相對生長率從大到小為試驗2 組> 試驗1 組> 試驗3 組> 對照3 組 > 對照2 組> 對照1 組。經(jīng)統(tǒng)計分析, 對照1 組與試驗1 、2組間差異在0 .01 水平顯著, 與試驗3 組、對照2 、3 間差異在0 .05 水平顯著, 其他組間無差異�？梢�,0 .08 % 杜仲提取物、大蒜素復(fù)方可有效促進(jìn)草魚的生長;0 .04% 與0 .12 % 復(fù)方的促生長作用接近0 .08% 單方, 說明復(fù)方在0 .04 % ～0 .08% 濃度范圍內(nèi)更能協(xié)同促進(jìn)草魚的生長, 而在0 .08% ～0 .12% 濃度范圍內(nèi)沒有協(xié)同促生長作用。 2 .2 攻毒后的成活率攻毒后, 各組魚活動異常,3 d 后魚體表開始出現(xiàn)紅色斑點, 并陸續(xù)死亡。對病原菌分離培養(yǎng), 發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢菌為熒光假單胞菌。由表4 可知, 各組成活率依次為 試驗2 組> 試驗3 組、對照3 組> 試驗1 組、對照2 組> 對照1 組。經(jīng)卡方檢驗, 對照1 組與其他組成活率間存在顯著或極顯著差異; 對照2 組與試驗1 組、對照2 組成活率間存在0 .05 水平顯著差異。這說明各組所用添加劑均可有效提高草魚攻毒后的成活率; 復(fù)方組的成活率高于同劑量的杜仲提取物單方組, 接近高劑量的單方組, 表明兩種藥物復(fù)方添加0 .04～0 .08 % 在提高存活率方面具有協(xié)同作用。各組添加劑的免疫保護(hù)力以試驗2 組最高。
2 .3 凝集抗體效價由表5 可知,28 d 時, 各組魚的抗體效價達(dá)較高水平, 從大到小依次為試驗2 組> 試驗3 組> 對照2 組> 對照3 組> 試驗1 組> 對照1 組。經(jīng)方差分析, 對照1組與其他組抗體效價均有0 .01 水平顯著差異; 對照2 、3 組與試驗1 、3 組之間不存在差異, 與試驗2 組差異在0 .05 水平顯著。這表明杜仲提取物、大蒜素以及不同比例復(fù)方均可提高草魚的抗體效價; 杜仲提取物與大蒜素復(fù)方提高草魚抗體效價的作用, 接近高劑量的單方, 高于同劑量的單方, 說明兩種藥物復(fù)方0 .04% ～0 .08 % 對提高草魚的抗體效價有協(xié)同作用, 但過高劑量的復(fù)方抗體效價略有下降, 但沒有明顯變化。21 d 的情況與此相近。
2 .4 白細(xì)胞的吞噬活性由表6 可知, 對照1 組的吞噬百分比與對照3 組、試驗1 、2 、3 組差異在0 .05 水平顯著, 對照2 組的吞噬百分比在0 .05 水平顯著低于試驗2 組; 對照1 組的吞噬指數(shù)與其他各組差異在0 .05 水平顯著, 對照2 、3 組的吞噬指數(shù)與試驗2 組間差異在0 .05 水平顯著。這說明杜仲提取物、大蒜素以及復(fù)方均可提高草魚血液中白細(xì)胞的吞噬活性; 杜仲提取物與大蒜素復(fù)方的吞噬活性高于同樣添加劑量的單方, 等同于高劑量的單方, 可見兩種藥物復(fù)方對提高草魚白細(xì)胞的吞噬指數(shù)有協(xié)同作用。
3 結(jié)論與討論 試驗表明, 杜仲提取物與大蒜素復(fù)方在提高草魚抗體效價、吞噬活性及攻毒后的成活率方面均表現(xiàn)了一定的協(xié)同作用。從中藥藥理分析, 大蒜“味辛, 性溫, 暖胃行氣, 消腫解毒”, 杜仲“味甘、辛, 性溫, 補腰壯骨, 安胎助陽”[11] 。兩種藥物性味相似, 功能不同。按照中草藥配伍原理, 兩者復(fù)方屬于“相須”。但在傳統(tǒng)驗方中, 未見有兩者配伍的現(xiàn)象。按照西醫(yī)藥理, 杜仲對細(xì)胞免疫具有雙向調(diào)節(jié)作用, 能激活單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)和腹腔巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的吞噬活力以及體液免疫功能, 其作用與所含的木脂素、環(huán)烯醚萜類、黃酮類和三萜類等化合物密切相關(guān)[ 12] 。大蒜素能抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮, 提高淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和T 淋巴細(xì)胞酸性α-醋酸萘酯( ANAE) 陽性率, 使中樞淋巴器官和外周淋巴器官增殖, 增強細(xì)胞免疫功能[ 13] ; 大蒜素能增加小鼠脾臟抗體形成細(xì)胞數(shù)量, 明顯增強動物體液免疫功能[ 14] , 還能明顯增強小鼠腹腔MΦ 吞噬功能, 促進(jìn)小鼠T 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化, 增強NK 細(xì)胞活性的作用, 從而提高機體自身免疫功能[ 15] 。兩種藥物有效成分的作用途徑各不相同, 而且相互間沒有直接的關(guān)系。協(xié)同作用的產(chǎn)生可能是由于更多有效成分在多靶點與多系統(tǒng)的綜合效應(yīng), 其具體藥理機制有待進(jìn)一步研究。通過提取杜仲所含有的藥理成分, 仕仲添加劑的添加劑量從4 % 降低至0 .1% , 仍可有效改善主要養(yǎng)殖魚類免疫力[ 3 ,4 ,8] ; 通過杜仲提取物與大蒜素復(fù)方, 使有效改善魚類免疫力的添加劑量降至0 .04 % , 達(dá)到了飼料添加劑“高效、微量”的要求。提取與配伍是中草藥飼料添加劑達(dá)到“微量”的有效途徑。在魚類養(yǎng)殖生產(chǎn)中, 可根據(jù)當(dāng)?shù)氐馁Y源情況, 選擇最經(jīng)濟的飼料添加劑與添加方式。 參考文獻(xiàn) [1] 晏援, 郭丹. 杜仲葉的化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展[J] . 中成藥,2003 ,25(6) :491 - 492 . [2] 姚紅梅, 肖克宇, 鐘蕾. 杜仲在養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用[J] . 養(yǎng)殖與飼養(yǎng),2005 ,2(5) :21- 23. [3] 羅慶華, 盧向陽, 李文芳. 杜仲葉粉對鯉魚肌肉品質(zhì)的影響[J] . 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報: 自然科學(xué)版,2002 ,28(3) :224 - 226 . [4] 羅慶華. 杜仲葉粉對鯉魚免疫力的影響[J] . 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報: 自然科學(xué)版,2002 ,28(1) :51 - 53 . [5] 何榮海, 馬海樂. 大蒜有效成分的提取研究進(jìn)展[J] . 食品科技,2004(10) :40 - 42 . [6] 高紅梅, 王明學(xué). 大蒜素及其在水產(chǎn)健康養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J] . 飼料工業(yè),2004,25(10) :21. [7] 羅慶華, 盧成英, 李立君, 等.10 種中草藥的體外抑菌試驗[J] . 中國獸醫(yī)科技,2002 ,32(3) :38 - 39 . [8] 姚紅梅. 杜仲提取物對彭澤鯽抗病和促生長的研究[ D] . 長沙: 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),2005 . [9] 安麗英. 獸醫(yī)實驗技術(shù)[ M] . 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社,2000:224- 226 . [10] 陳昌福, 李靜, 吳志新. 不同方法提取兩種魚類病原菌脂多糖的化學(xué)成分分析[J] . 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1996 ,15(2) :157 - 162. [11] 馮洪錢. 民間獸醫(yī)本草[ M] . 北京: 科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社,1984 :388 ,500 . [12] 程光麗. 杜仲有效成分分析及藥理學(xué)研究進(jìn)展[J] . 中成藥,2006 ,28(5) :5- 8 . [13] 張志勉, 高海青, 魏瑗. 大蒜素對腫瘤患者細(xì)胞免疫功能的影響[J] . 山東大學(xué)學(xué)報: 醫(yī)學(xué)版,2003 ,41(2) :148 - 150 . [14] 張曉利, 張紅軍, 唐曉云, 等. 大蒜素對小鼠免疫功能的影響[J] . 中醫(yī)藥學(xué)報,1998(1) :57 - 58 . [15] 朱金水, 蔣西華, 陳維雄, 等. 導(dǎo)向大蒜素抗大鼠胃癌分子免疫機制[J] . 腫瘤,1998,18(3) :222- 223 .__ 相關(guān)產(chǎn)品鏈接： |
