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杜仲葉醇提取物對(duì)大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用

【關(guān)鍵詞】  動(dòng)脈粥樣硬化；杜仲葉；醇提取物；內(nèi)皮細(xì)胞；綠原酸；杜仲提取物

　　杜仲具有降低血脂、平衡調(diào)節(jié)血壓等功效〔1〕,近來(lái)的研究顯示杜仲葉醇提取物(Alcohol extractive of Folium Eucommiae，AEFE)還可作用于內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)一氧化氮(NO)的釋放〔2〕。本實(shí)驗(yàn)首次觀察AEFE對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化(AS)大鼠血漿NO、內(nèi)皮素(ET)��1、6�餐��睬傲邢偎谾1α(6�睰eto�睵GF1α)、血栓素B2(TXB2)水平和主動(dòng)脈、冠狀動(dòng)脈形態(tài)的影響，探討AEFE對(duì)AS大鼠內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。

　　1  材料與方法

　　1.1  動(dòng)物 

　　雄性SD大鼠，體重200～250 g，鼠齡80～120 d。由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(醫(yī)學(xué)動(dòng)物合格證：SCXK渝20020003)。

　　1.2  藥品與試劑 

　　AEFE：根據(jù)文獻(xiàn)〔3〕制備并濃縮至100％(相當(dāng)于1 ml含生藥1 g)備用，用時(shí)以0.5％羧甲基纖維素稀釋?zhuān)挥芍貞c醫(yī)科大學(xué)化學(xué)教研室提供并鑒定。洛伐他�。褐貞c大新藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)040501。膽固醇：北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)DH061；豬膽鹽：北京奧博星生物技術(shù)有限公司，批號(hào)20050308；丙硫氧嘧啶：上海復(fù)星朝暉藥業(yè)有限公司，批號(hào)040708；VitD3注射液：上海通用藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)041108。NO測(cè)定試劑盒：南京建成生物工程研究所；ET��1、6�睰eto�睵GF1α和TXB2放射免疫試劑盒：解放軍總醫(yī)院科技開(kāi)發(fā)中心放免所；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

　　1.3  實(shí)驗(yàn)儀器 

　　3K30型高速低溫離心機(jī)：美國(guó)Sigma公司；722型分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；SN��695B型放射免疫測(cè)定儀：上海核輻光電儀器設(shè)備有限公司。

　　1.4  方法

　　1.4.1  大鼠AS模型的復(fù)制和實(shí)驗(yàn)分組 

　　參考文獻(xiàn)〔4〕方法建立大鼠AS模型，于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)給予模型組及各給藥組大鼠腹腔注射VitD3注射液(總劑量60 萬(wàn)U/kg,分3 d給完)，同時(shí)給予高脂飼料(3％膽固醇，0.5％豬膽鹽，0.2％丙硫氧嘧啶，5％白糖，10％豬油，81.3％基礎(chǔ)飼料)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為6組，每組8只：正常對(duì)照組，普通基礎(chǔ)全價(jià)飼料；AS模型組：高脂飼料；AEFE高中低劑量組，高脂飼料＋AEFE (420，140，70 mg·kg-1·d-1)；洛伐他汀組：高脂飼料＋洛伐他汀(4 mg·kg-1·d-1)。各給藥組在造模2 w后開(kāi)始灌胃給藥(0.5 ml/100 g濕重)，共給藥6 w。實(shí)驗(yàn)周期為8 w。

　　1.4.2  血漿NO、ET��1、6�睰eto�睵GF1α和TXB2含量測(cè)定 
　　大鼠抗凝血2 ml，4℃，3 000 r/min離心10 min，取血漿化學(xué)法測(cè)定NO、放射免疫法測(cè)定ET��1、6�睰eto�睵GF1α和TXB2，均按試劑盒操作進(jìn)行。

　　1.4.3  主動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈形態(tài)學(xué)觀察 

　　取主動(dòng)脈和心臟用10％甲醛固定，石蠟包埋切片，HE染色光鏡觀察。

　　1.5  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
 
　　數(shù)據(jù)用x±s表示，結(jié)果用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和方差分析處理。

　　2  結(jié)  果

　　2.1  AEFE對(duì)血漿NO和ET��1含量的影響 

　　AS模型組血漿NO和ET��1濃度與正常對(duì)照組相比均明顯降低(P＜0.01)；與AS模型組相比，AEFE低劑量組兩指標(biāo)改變無(wú)明顯差異，AEFE中、高劑量組和洛伐他汀組NO和ET��1濃度明顯升高(P＜0.01)。AEFE中、高劑量組NO水平高于洛伐他汀組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

　　2.2  AEFE對(duì)血漿6Keto�睵GF1α和TXB2含量的影響 

　　AS模型組與正常對(duì)照組相比血漿6�睰eto�睵GF1α濃度明顯降低而TXB2濃度顯著升高(P＜0.01)；與AS模型組相比，AEFE低劑量組兩指標(biāo)改變無(wú)明顯差異，AEFE中、高劑量組和洛伐他汀組6�睰eto�睵GF1α濃度明顯升高(P＜0.01)，洛伐他汀組達(dá)到正常水平，但各組TXB2濃度無(wú)差異(表1)。表1  各組大鼠血漿NO、ET��1、6�睰eto�睵GF1α和TXB2濃度的變化(略)

　　2.3  AEFE對(duì)主動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈形態(tài)的影響 

　　正常對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈結(jié)構(gòu)完整，層次清晰，內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)完整。AS模型組主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞呈連續(xù)性缺失，底層膠原纖維暴露，內(nèi)皮下間隙增寬，內(nèi)彈力板分離斷裂；AEFE低劑量組病理改變基本同AS模型組；AEFE中、高劑量組和洛伐他汀組動(dòng)脈結(jié)構(gòu)完整，層次清晰,內(nèi)膜較光滑，偶見(jiàn)局部少量?jī)?nèi)皮細(xì)胞缺失。AS模型組冠狀動(dòng)脈可見(jiàn)連續(xù)性內(nèi)皮細(xì)胞缺失、數(shù)目不一的泡沫細(xì)胞和鈣質(zhì)沉著；AEFE低劑量組冠脈改變基本同AS模型組，而中、高劑量組和洛伐他汀組內(nèi)皮基本完整，其下偶見(jiàn)泡沫細(xì)胞，管壁可見(jiàn)輕度增厚和少量鈣質(zhì)沉著，其病變程度明顯好于AS模型組,但三組間無(wú)顯著差異(圖1和圖2)。

　　3  討  論

血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷被認(rèn)為是AS最重要的始動(dòng)環(huán)節(jié)，繼發(fā)于它的內(nèi)皮通透性、黏附性、血液凝固性改變及所釋放的大量細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子將導(dǎo)致AS發(fā)生的一系列連鎖反應(yīng)〔5〕。血管內(nèi)皮的正常功能是通過(guò)內(nèi)皮分泌血管活性物質(zhì)(如NO，ET��1及PGI2等)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，因此內(nèi)皮損傷后首先表現(xiàn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌功能的失調(diào)。有研究表明高血脂癥可引起ET��1含量升高、NO水平下降〔6，7〕；然而部分學(xué)者認(rèn)為高血脂癥對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有毒性作用，損壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，引起ET��1、NO水平均降低〔8，9〕。孫金明等〔10〕研究高血脂癥對(duì)內(nèi)皮血管活性物質(zhì)合成和釋放的動(dòng)態(tài)影響，結(jié)果顯示高血脂癥對(duì)ET�瞝基因表達(dá)及ET�瞝含量的影響呈波動(dòng)性變化，高血脂癥初中期ET��1基因的表達(dá)升高，隨后呈下降趨勢(shì)。PGI2和TXA2維持平衡對(duì)預(yù)防AS的發(fā)生，防止血栓形成有著重要的調(diào)節(jié)作用。由于兩者的不穩(wěn)定性，故目前均以測(cè)定6�睰eto�睵GF1α和TXB2作為判斷其濃度的指標(biāo)。在AS發(fā)病過(guò)程中，ox�睱DL增加，細(xì)胞過(guò)氧化脂質(zhì)的升高，可以抑制血管壁PGI2合酶的活性，使PGI2合成減少，而血小板TXA2生成增加。

在本實(shí)驗(yàn)中，高膽固醇飲食造模8 w后，AS模型組大鼠血漿NO、ET��1和6�睰eto�睵GF1α含量較正常組明顯降低，TXB2濃度明顯升高，同時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞有連續(xù)性缺失，血管結(jié)構(gòu)紊亂，說(shuō)明模型組血管內(nèi)皮功能和結(jié)構(gòu)受到明顯的損傷,動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生；AEFE中、高劑量和洛伐他汀能明顯增加血漿NO、ET��1和6�睰eto�睵GF1α水平，使主動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷減輕、血管結(jié)構(gòu)基本正常，但對(duì)TXB2無(wú)影響，提示AEFE具有維持NO/ET和TXA2/PGI2平衡、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，防治AS的作用。此時(shí)的NO、ET��1和PGI2水平升高是內(nèi)皮功能修復(fù)的一種表現(xiàn)，對(duì)TXA2無(wú)影響提示AEFE的作用靶點(diǎn)不在血小板。AEFE升高NO的作用較洛伐他汀明顯，而對(duì)PGI2水平的影響不及洛伐他汀，說(shuō)明兩藥對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能的修復(fù)影響環(huán)節(jié)不相同。AEFE中、高劑量?jī)山M療效無(wú)明顯差異可能是AEFE 140 mg·kg-1·d-1已接近最大效應(yīng)，故增加劑量藥物效應(yīng)無(wú)顯著增加。

    附注：

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