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熊果酸對(duì)胰島素抵抗大鼠肝臟組織PTP-1B、IRS-2mRNA表達(dá)的影響
熊果酸是存在于天然植物中的一種三萜類化合物．在酸味中藥如山茱萸、山楂、烏梅、五味子中含量豐富，具有抗腫瘤、降血糖、抗氧化、降血脂等多種藥理活性。近年來國內(nèi)外均有文獻(xiàn)報(bào)道熊果酸能夠增加胰島素的敏感性，降低血糖 本實(shí)驗(yàn)用熊果酸對(duì)胰島素抵抗模型大鼠進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)肝臟組織蛋白酪氨酸磷酸酯酶-lB (PTP-1B)、胰島素受體底物-2(IRS-2)mRNA表達(dá)的影響，探討其改善胰島素抵抗的分子機(jī)制。
關(guān)鍵詞：熊果酸 胰島素 PTP-1B
1 材料與方法
1．1 藥物、試劑與儀器 熊果酸(長沙上禾生物科技有限公司有售)，純度>98％ ，以含5g/L 羧甲基纖維素鈉的PBS溶液(pH7.4)分別配制成含熊果酸 50g/L、25g/L的混懸液；鹽酸二甲雙胍片購于上海信誼制藥總廠，采用水磨法，以含5g/L 羧甲基纖維素鈉的PBS溶液配制成含二甲雙胍33g/L 的混懸液； BIO-RAD CareSens血糖儀、試紙購于韓國i-SENS公司：胰島素ELISA試劑盒購于上海達(dá)為科生物科技有限公司；DEPC處理水； 氯仿(HPLC級(jí)； 焦碳酸二乙酯 ，購于上海生物工程技術(shù)公司；TriZO1試劑盒：SYBR Green PCR試劑盒：Real-time PCR檢測(cè)儀ABI-7500。
1．2 模型制備、動(dòng)物分組及給藥 8周齡清潔級(jí)雄性健康 Wistar大鼠6O只．體重180～200g。先適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后．隨機(jī)抽取l2只設(shè)為正常組．剩下的48只大鼠為模型組正常組飼以基礎(chǔ)飼料．由第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，模型組飼以高脂飼料：基礎(chǔ)飼料(78.9g)基礎(chǔ)上加豬油10g、膽固醇lg、蛋黃粉lOg、膽鹽0.1g，模型組大鼠高脂喂養(yǎng)9周后．將大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分組．每組12只，分為熊果酸高、低劑量組，分別按300mg/(kg·d)～、150mg/(kg·d) 的劑量灌上述熊果酸混懸液：二甲雙胍組，按200mg/(kg.d)-1的劑量灌上述二甲雙胍混懸液：正常對(duì)照組和模型對(duì)照組．灌等體積含5g/L--羧甲基纖維素鈉的PBS溶液：除正常組飼以基礎(chǔ)飼料．其他各組給藥同時(shí)繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)．所有大鼠均全程自由飲水
1．3 指標(biāo)檢測(cè)及方法 藥物干預(yù)第4 周、8周后．各組分別按體質(zhì)量隨機(jī)取6 只大鼠．禁食6h．乙醚麻醉下眼眶靜脈取血．分離血清．低溫保存待檢 動(dòng)物斷頸處死后迅速取出肝臟稱取肝濕重．在每只大鼠同一肝葉和部位切取小塊組織．置入10％ 甲醛緩沖液中固定：再取同一肝葉和部位的肝組織2～4塊置人凍存管于-80℃保存
l.3．1 一般情況 觀察各組大鼠飲食行為、精神、活動(dòng)狀態(tài)、毛發(fā)等情況。 1-3．2 空腹血糖、血清胰島素、胰島素敏感指數(shù)及血脂測(cè)定 以禁食6h (7：00AM-13：00PM)血糖及疵清胰島素水平定為空腹血糖(FBG)和空腹胰島素fFINS)水平．血糖水平采用微量血糖儀測(cè)定：胰島素水平運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定；胰島素敏感指數(shù) (ISI)用李氏法計(jì)算．即ISI=1n 1/(空腹胰島素濃度X空腹血糖濃度)]：ff『L清血脂：包括TC、LDL-C．采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定.
1.3.2 肝臟指數(shù)測(cè)定 稱取肝臟濕重(LW)．并計(jì)算肝臟指數(shù) (LI)．LI=肝重／體重XlO0％
1.3.3 病理學(xué)檢查石蠟切片.HE染色．光鏡下觀察肝臟組織的脂肪變性、纖維化及炎癥等病理變化
1.3.4 肝臟P1rP-1B、IRS-2mRNA 測(cè)定 用Real-time PCR 法檢測(cè)肝臟PTP-1B、IRS-2mRNA 按Triz0l試劑盒說明書提取肝臟組織總RNA 上下游引物由上海達(dá)為科生物科技公司合成。P1-1B上游引物：5"-ACC CTG TGC GGA AAT GCG GG-3 ：下游引物：5"-GGC AGT CAG TCA ACC CCG GC-3／0 IRS-2上游弓l物：5 -TGC GAA CAG CCG TCG GTG AC-3 ：下游引物：5"-GAC CGG TGA CGG CTG AAC GG一3 GAPDH 上游引物：5"-AGA ACA TCA TCC CTG CAT CC-3 ：下游引物：5"-TGG ATA CAT TGG GGG TAG GA-3 反轉(zhuǎn)錄后行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。mRNA相對(duì)表達(dá)量：2 zcrx100％．ACT=目標(biāo)基因CT值一內(nèi)參(GAPDH)CT值
1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。多樣本統(tǒng)計(jì)采用單因素方差分析。 P
2 結(jié)果
2．1 一般情況正常組大鼠精神狀態(tài)良好、飲食正常、精力充沛。皮毛整潔；模型組大鼠精神萎靡，懶惰，性情較溫順，皮毛凌亂欠光澤：用藥組均有不同程度的飲食和活動(dòng)減少．皮毛欠光澤.
2．2 大鼠FBG、FINS、胰島素敏感指(ISI1、血脂的變化 熊果酸對(duì)大鼠FBG無明顯影響．各組間比較差異無顯著性 (P>0.05)：與同期模型組大鼠比較治療組FINS顯著降低.ISI升高，TC、LDL-C降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或 P<0.01)．提示熊果酸能夠明顯改善IR , 2-3 大鼠體重、肝臟指數(shù)的變化 高脂飲食可致IR模型大鼠的體重、肝質(zhì)量增加，肝臟指數(shù)明顯升高；熊果酸和二甲雙胍均能明顯降低IR模型大鼠的體重及肝指數(shù)(P<0.01或 P<0.05)。詳見表2。
2．4 肝臟病理學(xué)觀察
2．4．1 解剖觀察正常組大鼠肝臟呈鮮紅色。邊緣比較銳利．表面光滑。模型組肝臟體積明顯增大，邊緣變鈍，呈土黃色．質(zhì)軟，切面有油膩感，呈典型脂肪肝外觀：用藥組部分肝臟接近正常，肝臟體積稍大，表面呈淺黃色，油膩感減輕。
2．4．2 光鏡觀察正常對(duì)照組大鼠肝組織形態(tài)學(xué)未見明顯異常：模型組大鼠呈重度肝細(xì)胞脂肪變性．肝細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)大小不等的脂肪空泡，有些肝細(xì)胞充滿脂肪，胞核消失．整個(gè)細(xì)胞變成大的空泡部分肝細(xì)胞溶解壞死．肝細(xì)胞問見少量炎性細(xì)胞浸潤，有輕微纖維化改變：用藥組肝臟病理呈不同程度的改善，以輕度至中度脂肪變性為主．脂肪變肝細(xì)胞數(shù)目減少．肝細(xì)胞形態(tài)大致正常，胞漿內(nèi)脂滴減少或消失，胞漿豐富．無或偶見少量炎性細(xì)胞浸潤．無纖維化改變。見圖1 圖2
2．5 肝組織PTP-1B、IRS-2mRNA表達(dá) 正常組肝組織IRS-2mRNA 呈高水平表達(dá)．PTP-lBmRNA呈低水平表達(dá)：模型組肝組織 IRS-2mRNA 呈低水平表達(dá)．PTP-1BmRNA呈高水平表達(dá)：熊果酸及二甲雙胍均可不同程度增加IRS-2mRNA 的表達(dá)．降低PTP-1BmRNA表達(dá) 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．01或P<0．05)
3 討論
肝臟是胰島素(Ins)作用的主要靶器官．肝臟IR時(shí)主要表現(xiàn)為Ins與受體結(jié)合后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)引起的一系列代謝過程受到阻礙．呈現(xiàn)出 Ins反應(yīng)性降低 發(fā)生在胰島素受體底物(IRS1蛋白分子水平上的IR是常見的一種．IRS基因表達(dá)的降低、蛋白量的減少及功能障礙都會(huì)影響Ins信號(hào)的有效傳遞而導(dǎo)致IR 胰島素受體底物-2(IRS～2)主要在肝臟和胰島B 細(xì)胞表達(dá)．IRS-2基因缺乏的小鼠出現(xiàn)外周IR和代償性Ins分泌不足．提示IRS～2蛋白是聯(lián)系外周IR 和B細(xì)胞功能缺陷的重要介質(zhì) IRS-2主要通過類醇淵節(jié)元件結(jié)合蛋白 (SREBP)調(diào)控脂質(zhì)合成．IRS-2下凋可影響其下游PI3K／Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)．導(dǎo)致肝糖原合成減少．脂肪合成增加．提示肝細(xì)胞的脂肪變與肝臟IR 密切相關(guān)l61 P～1B能與胰島素受體、IRS 等信號(hào)蛋白作用．使這些蛋白調(diào)節(jié)區(qū)的酪氨酸殘基去磷酸化．阻斷Ins信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下傳在糖尿病動(dòng)物模型的肝臟和骨骼肌中降低PTP-1B的表達(dá)水平．可增加胰島素受體及其底物的酪氨酸磷酸化水平。增強(qiáng) Ins信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)．提高對(duì)Ins的應(yīng)答 本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)．熊果酸能夠降低高脂飲食誘導(dǎo)的IR 大鼠體重、H-F臟指數(shù)．改善脂質(zhì)代謝及肝臟脂肪變性，降低空腹m清Ins．增加Ins敏感性，作用效果和二甲雙胍相似．高、低劑量組之間未發(fā)現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。其作用機(jī)制可能與熊果酸抑制PTP-1BmRNA表達(dá)從而上調(diào)IRS-2mRNA表達(dá)有關(guān)中醫(yī)中藥復(fù)方及單味藥在改善IR方面均有一定優(yōu)勢(shì)和潛力，具有多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)、且作用相對(duì)安全的特點(diǎn)I8刪 IR涉及多個(gè)系統(tǒng)的疾�。缣悄土繙p低或糖尿病、肥胖、高脂血癥、脂肪肝、高血壓、冠心病等，且往往m現(xiàn)在疾病的早期階段。因此，在IR早期．及時(shí)、長期進(jìn)行干預(yù)預(yù)防和治療以減緩或逆轉(zhuǎn) IR．可以體現(xiàn)中醫(yī)中藥的優(yōu)勢(shì)。
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