夏枯草果穗熊果酸超臨界萃取的研究
夏枯草(Prunella vuIgaris Linn．)為唇形科夏枯草屬植物，因“夏至后即枯”得名，是常用傳統(tǒng)中藥之一，有多種藥效。熊果酸是夏枯草中的主要功能成分之一，熊果酸具有抗腫瘤、抗HIV、抗糖尿病、抗菌、抗病毒、增強免疫功能和降血脂等多種生物學(xué)活性。如何將夏枯草中熊果酸有效提取出來，是許多研究者關(guān)心的問題。目前，熊果酸的提取方法有回流提取法、索氏提取法、冷浸提取法、超聲波提取法、超高壓提取法和超臨界流體萃取法等方法。超臨界流體萃取是以一種超臨界流體在高于臨界溫度和壓力下從目標(biāo)物中萃取有效成分、當(dāng)恢復(fù)到常壓常溫時溶解在流體中成分即以溶于吸收液的液體狀態(tài)與氣態(tài)流體分開的提取原料中有效成分的技術(shù)，與傳統(tǒng)的提取分離法相比，超臨界流體萃取的最大優(yōu)點是在近常溫條件下提取分離不同極性、不同沸點的化合物，幾乎保留全部有效成分，無有機溶劑殘留、產(chǎn)品純度高、收率高、操作簡單、節(jié)能。本文以湖南邵陽產(chǎn)的夏枯草果穗為研究對象，采用超臨界二氧化碳流體萃取技術(shù)，以萃取溫度、萃取時間、萃取壓力、攜帶劑為影響因素，以熊果酸提取率為考察指標(biāo)，研究萃取溫度、萃取時間、萃取壓力、攜帶劑對夏枯草果穗中熊果酸提取的影響，優(yōu)化夏枯草果穗中熊果酸的提取條件。
1材料與方法
1.1材料、儀器與試劑
夏枯草果穗，采于湖南邵陽。 N2000高效液相色譜儀系統(tǒng) （北京溫分分析儀器技術(shù)開發(fā)有限公司)、超越2000色譜工作站(浙江大學(xué)智能信息研究所))、超臨界CO2萃取裝置(南通市飛宇石油科技開發(fā)有限公司)、TGL-16M高速臺式離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)、FSJ-1 14植物標(biāo)本粉碎機(牧漁業(yè)扶溝科技儀器廠)．無水乙醇為化學(xué)純；無水甲醇為色譜純；熊果酸對照品。熊果酸對照品長沙上禾生物科技有售，規(guī)格：25%-98%。
1.2對照品溶液的制備
精密稱取熊果酸對照品14mg，置10ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，得濃度為1.440mg／ml 的對照品I液．取對照品I液1.0ml置10ml容量瓶中，以甲醇定容至刻度，搖勻，得濃度為0.144mg／ml 對照品Ⅱ液．
1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
分別精密吸取對照品Ⅱ液2.0、5.0、10.0、15.0、 20.0、25.0 ml進(jìn)樣，按下列色譜條件進(jìn)樣測定：色譜柱Nueleosil-CN分析柱(4.6ram×250mm x 50mm)；流動相：無水甲醇；流速：1.0ml／min；檢測波長：220nm；柱溫：室溫．以進(jìn)樣量(x)為橫坐標(biāo)， 峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.4精密度試驗
精密吸取對照品Ⅱ液，重復(fù)進(jìn)樣5次，測定峰面積，進(jìn)行精密度試驗。
1.5加樣回收率實驗
精密吸取已測知濃度的供試品溶液500 ml，精密加入熊果酸對照品溶液(1.44mg／m1)100 ml，混勻，進(jìn)樣 l5ul，按樣品含量測定方法測定，計算回收率，進(jìn)行加樣回收率實驗。
1.6超臨界二氧化碳流體萃取工藝流程
將夏枯草果穗洗凈于60℃烘烤至干，粉碎，過 60目篩，備用。稱取100g夏枯草果穗粉裝入500 ml 的不銹鋼萃取釜中，開啟主泵，達(dá)到設(shè)置條件，將夏枯草果穗粉靜態(tài)萃取30 min，再開啟小泵動態(tài)萃取，萃取完畢后即瀉壓關(guān)機，得到萃取液。
1.7萃取物中熊果酸含量的測定
將所得萃取液除去溶劑干燥后即得萃取粗品，準(zhǔn)確稱重．將萃取物粗品用甲醇定容于50 ml容量瓶中，用高效液相色譜外標(biāo)法測定萃取粗品中熊果酸含量，測定條件為：色譜柱：Nueleosil-CN分析柱(4.6mm ×250mm ×50mm)；流動相：無水甲醇；流速：1.0ml／min；檢測波長：220nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量10ul。
2結(jié)果與分析
2.1熊果酸對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
以熊果酸對照品進(jìn)樣量(x)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y) 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 得回歸方程為 Y=220215.0X-7590.60(r=0．9999)，熊果酸的進(jìn)樣量在 0.28～3.60 g范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。2.2精密度試驗結(jié)果
精密吸取對照品Ⅱ液，重復(fù)進(jìn)樣5次，每次5 ul，進(jìn)行高效液相色譜測定，測定峰面積．結(jié)果表明，相對標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)為1.34％(n=5)，說明本方法的精密度良好。
2.3加樣回收率實驗結(jié)果
精密吸取已測知濃度(0.162g/l)的供試品溶液500 l，精密加入熊果酸對照品溶液(1．44 mg/m1)100l，混勻，進(jìn)樣15ul，按樣品含量測定方法測定，計算回收率．結(jié)果表明，平均回收率為 99.45％(RSD=0.81％)。
2.4單因素試驗結(jié)果
2.4.1攜帶劑的選擇 分別用相同體積(100m1)的甲醇、乙醇、甲醇和乙醇的混合物作攜帶劑及不加任何攜帶劑，在萃取溫度30％ 、萃取壓力20Mpa、萃取時間75min條件下，對夏枯草果穗中熊果酸進(jìn)行超臨界流體萃取，結(jié)果可以看出，加攜帶劑和不加攜帶劑對萃取效果有明顯的影響，加攜帶劑的萃取效果較好，在攜帶劑的選擇中以甲醇和乙醇的混合物效果較好。
2.4.2攜帶劑用量對熊果酸提取率的影響 在萃取溫度30℃ 、萃取壓力20Mpa、萃取時間 75min條件下，分別加入攜帶劑50、 100、150、20Oml，攜帶劑用量對熊果酸提取率的影響可以知道，攜帶劑用量為5Oml時，萃取率較低，攜帶劑用量為100、150、200ml時，萃取率較高且相近，攜帶劑用量選擇100ml較適宜。
2.4.3萃取時間對熊果酸提取率的影響 在萃取溫度30℃、萃取壓力20Mpa、攜帶劑用量1OOml，萃取時間分別為30、45、 60、75、90、105min條件下，萃取時間對熊果酸提取率的影響是萃取率隨萃取時間的延長而增大，萃取時間為30、45、60、75min時萃取率較低，萃取時間為90、105 min時，萃取率較高且相近，萃取時間選擇90min適宜。
2.4.4萃取溫度對熊果酸提取率的影響 在萃取壓力20Mpa、萃取時間90min、攜帶劑用量1OOml，萃取溫度分別為15、20、 25、30、35℃條件下，萃取溫度對熊果酸提取率的影響是，萃取取溫度在l5～30℃范圍內(nèi)，熊果酸萃取率隨溫度升高增加，30℃熊果酸萃取率最高，超過30℃~C時萃取率下降，萃取溫度選擇30℃比較適宜。
2.4.5萃取壓力對熊果酸提取率的影響 在萃取溫度30℃、萃取時間90min、攜帶劑用量 1OOml，萃取分別為壓力10、l5、 20、25、30、35Mpa條件下，萃取壓力對熊果酸提取率的影響在萃取壓力10Mpa 時，萃取率較低，萃取壓力為15Mpa，萃取率較高，萃取壓力選擇15Mpa比較適宜。
2.5優(yōu)化提取工藝條件的確定
在單因素的基礎(chǔ)上，選用L9(33 )進(jìn)行正交實驗，以熊果酸提取率為指標(biāo)，考察萃取溫度、萃取時間、萃取壓力、攜帶劑對熊果酸提取率的影響，極差分析結(jié)果可知，A因素(溫度)的R值最大，因素的極差越大，說明該因素的變動對結(jié)果的影響越大，即A因素((溫度)為最重要的因素．根據(jù)表3中R值的大小，排列出試驗因素的主次順序： A>D>C>B．正交試驗結(jié)果即萃取溫度 30℃ ，萃取壓力15MPa，攜帶劑甲醇：乙醇=1：1，萃取時間90min．對試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析和F 檢驗看出，萃取溫度、壓力、攜帶劑、時間對夏枯草果穗熊果酸的萃取有顯著影響，其中萃取溫度影響最大．
在最佳組合條件下對夏枯草果穗中的熊果酸進(jìn)行萃取，并進(jìn)行HPLC分析，超臨界CO2萃取夏枯草果穗熊果酸的效果好，萃取物中的熊果酸含量高，有利于粗提物的進(jìn)一步分離與純化．
3 結(jié) 論
采用超臨界CO2萃取法萃取夏枯草果穗中的熊果酸，萃取效果好，萃取物中熊果酸含量高，熊果酸提取比較完全．超臨界CO2流體萃取夏枯草果穗熊果酸各因素影響程度為：萃取溫度>萃取時間>攜帶劑>萃取壓力．最佳條件為：萃取溫度為 30℃ ，萃取壓力為15MPa，攜帶劑甲醇：乙醇=1：1，萃取時間為90min。
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夏枯草果穗熊果酸超臨界萃取的研究 
