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金銀花和金銀花露中綠原酸和4種黃酮含量的測(cè)定

金銀花為忍冬科多年生半常綠纏繞植物忍冬的花蕾及初開(kāi)的花，又名忍冬花、銀花、雙花等，其主要成分有機(jī)酸——綠原酸具有抗菌、抗病毒及抗真菌、增強(qiáng)機(jī)體防御機(jī)能的作用，也是鑒定金銀花品質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)金銀花中含有木犀草素（上禾生物）、金絲桃苷、槲皮素、芹菜素等多樣黃酮類(lèi)化合物�，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，黃酮類(lèi)化合物具有降低心肌耗氧量，使冠脈、腦血管流量增加，軟化血管，降血糖、血脂等作用。同時(shí)黃酮還是一類(lèi)天然的抗氧化劑，具有抗衰老，增加機(jī)體免疫力的生理活性作用。鑒于此，金銀花中黃酮的含量也可以作為金銀花品質(zhì)檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)。目前對(duì)以上這5種物質(zhì)已經(jīng)建立的分析方法已經(jīng)有：阻抑催化褪色光度法 、分光光度法、高效液相色譜法、共振瑞利散射光譜法、催化動(dòng)力學(xué)光度法、流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法、毛細(xì)管電泳法等．但文獻(xiàn)中多為一種或兩種物質(zhì)的測(cè)定，而同時(shí)對(duì)金銀花中綠原酸和黃酮類(lèi)化學(xué)物進(jìn)行測(cè)定的報(bào)導(dǎo)還未曾出過(guò)。本文則建立了一種反相高效液相色譜法同時(shí)對(duì)綠原酸、金絲桃苷、木犀草素、槲皮素、芹菜素進(jìn)行測(cè)定，旨為增加對(duì)金銀花質(zhì)量檢測(cè)的補(bǔ)充。

1  實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilentl100高效液相色譜儀(美國(guó)，Agilent公司)；DF一101s集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(中國(guó)，鄭州 長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；DZF一6021真空干燥箱(中國(guó)，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)；pHs一3c酸度計(jì)(中國(guó)， 成都世紀(jì)方舟科技有限公司)．

綠原酸、金絲桃苷對(duì)照品(98%)，槲皮素對(duì)照品 (98%,中國(guó)藥品生物制品檢定)，木犀草素對(duì)照品(99%,中國(guó)藥品生物制品檢定),芹菜素對(duì)照品。甲醇(分析純)、磷酸(分析純)、金銀花樣品(購(gòu)于重慶市)和金銀花露(每 500 mL相當(dāng)于金銀花31.25 g)。水為二次蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

Eclipse XDB-C8柱(4.6×150 mm，5mm)；流動(dòng)相為甲醇-水(用磷酸調(diào)節(jié)pH-2.60)。采用梯度洗脫,檢測(cè)波長(zhǎng)340 nm；流 速0.8 mL／min；進(jìn)樣量為20uL。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

分別精密稱(chēng)取干燥至恒重的綠原酸、槲皮素、木犀草素和金絲桃苷對(duì)照品適量加甲醇溶解制成1.0 g/L的貯備液，芹菜素用熱的乙醇溶解制成1.0 g/L的貯備液。臨用前用貯備液配制一系列不同濃度的5種標(biāo)樣的混合溶液．進(jìn)樣20uL,以各組分峰面積y對(duì)其質(zhì)量濃度X(g/L)進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析，得到的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線(xiàn)性范圍及其檢測(cè)限。

1.2.3 樣品含量測(cè)定

精密稱(chēng)取金銀花試品粉末(過(guò)60目篩)2.000g，置圓底燒瓶中，加30 mL 70%乙醇(磷酸調(diào)pH- 2．6)，于86℃水浴回流1h，過(guò)濾，濾渣加2OmL 7O%乙醇(磷酸調(diào)pH-2.6)，重復(fù)上述步驟兩次，合并3 次提取液，放冷，轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶，稀釋至刻度，搖勻，取2.5 mL稀釋至100 mL，用0.45 m微孔 濾膜過(guò)濾，作為供試品溶液1；取金銀花露1 mL稀釋至10 mL作為供試品溶液2，按2.1色譜條件分析，外標(biāo)法計(jì)算含量。

1.2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

取同一濃度對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)得峰面積，計(jì)算得綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)偏差(RSD)為 2.8 9／6，金絲桃苷的RSD為1.4 ，槲皮素的RSD為2.O，木犀草素的RSD為1.1 9/6．表明該方法的精密度良好。

1.2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

按照2．3項(xiàng)下樣品的預(yù)處理過(guò)程分別同時(shí)處理金銀花樣品5份，測(cè)得綠原酸含量的RSD為1.69%；金 絲桃苷含量的RSD為2.4 ；槲皮素含量的RSD為2.1；木犀草素含量的RSD為1.8%。表明該方法的重現(xiàn)性良好。

1.2.6 加樣回收實(shí)驗(yàn)

精密量取已知含量的金銀花試液5份，分別精密加入綠原酸、金絲桃苷、槲皮素和木犀草素對(duì)照品，測(cè)定樣品的平均加標(biāo)回收率。

1.2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一樣品溶液，分別于0、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，綠原酸的RSD為0.87％ ，金絲桃苷的RSD為 0.63% ，槲皮素的RSD為0.95% ，木犀草素的RSD為0.77% ，表明樣品在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的選擇

黃酮類(lèi)成分在HPLC測(cè)定中易出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，在流動(dòng)相中加入磷酸，抑制其拖尾，提高峰形對(duì)稱(chēng)性。通過(guò)對(duì)不同比例的有機(jī)相及磷酸濃度的實(shí)驗(yàn)選擇，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇-水(磷酸調(diào)pH-2．6)系統(tǒng)比乙腈-水(磷酸調(diào)pH-2．6)系統(tǒng)分離效果好，故選擇甲醇-水(磷酸調(diào)pH=2．6)為流動(dòng)相。并根據(jù)這5種物質(zhì)的極性和分離情況，調(diào)整流動(dòng)相的配比，采用梯度洗脫。

2.2 實(shí)驗(yàn)測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

掃描各對(duì)照品在200～700 nm范圍內(nèi)的紫外吸收光譜，分析結(jié)果，實(shí)驗(yàn)選擇在330，340，350，360nm 處對(duì)混合樣測(cè)定，比較發(fā)現(xiàn)在340nm處所測(cè)定的峰面積相對(duì)較大，靈敏度較高，峰形較好，因此本實(shí)驗(yàn)采 用340nm作為測(cè)定波長(zhǎng)．

2.3 樣品處理方法的選擇

金銀花樣品分別用水浴回流提取與超聲提取處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水浴回流法提取的金絲桃苷、槲皮素和 木犀草素的總含量比超聲法的高出一倍，因?yàn)榛亓鞲�有利于苷的水解，�?shí)驗(yàn)比較選定磷酸緩沖，V (磷酸)：V(乙醇)-30：70水浴回流提取的方法。

3  結(jié)  論

文獻(xiàn)中的高效液相色譜法的測(cè)定結(jié)果線(xiàn)性范圍窄，靈敏度低；而其他方法也存在一定的不足，如：分光光度法選擇性較差，質(zhì)譜法對(duì)儀器的要求很高、價(jià)格昂貴，化學(xué)發(fā)光法和催化動(dòng)力學(xué)光度法操作手續(xù)煩 瑣等．而本文運(yùn)用反相高效液相色譜法對(duì)綠原酸、金絲桃苷、木犀草素、槲皮素、芹菜素同時(shí)測(cè)定，此法簡(jiǎn) 便，快速準(zhǔn)確，靈敏度高，重現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好，可用于金銀花的品質(zhì)檢測(cè)。

備注：