熊果酸對前列腺癌細胞作用的實驗研究 | 熊果酸對前列腺癌細胞作用的實驗研究 |
| 發(fā)布時間:2010-08-06 信息來源:admin 發(fā)布人:admin 點擊次數(shù):3080 |
雄激素非依賴性前列腺癌(AIPC)的發(fā)生是前列腺癌 (PCa)內(nèi)分泌治療的主要障礙。維持或恢復PCa細胞對雄激 素的反應性，延緩甚至阻止雄激素非依賴表型的出現(xiàn)，是目前探索和研究的方向。本實驗選用中藥有效成分熊果酸體外作用于PCa細胞，以探討AIPC的治療途徑及藥物。 1 材料與方法 1.1 細胞系：人雄激素依賴性前列腺癌(ADPC)細胞株LNCaP 和人AIPC細胞株DU145由本實驗室保存，培養(yǎng)基為RPMI一 1640。 1.2 藥物及試劑：熊果酸純品，DMSO 助溶。MTI"、人工合成雄激素R1881和雄激素阻斷劑氟他胺均 為Sigma公司產(chǎn)品。RPMI1640培養(yǎng)基(含和不含酚紅)及活性 炭／葡聚糖處理的胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品。 1.3 細胞生長分析：取對數(shù)生長期的LNCaP及DU145細胞，接種96孔培養(yǎng)板(LNCaP：6 x 10 個細胞／孔，DU145：4×10 個 細胞／孔)。每組設三個復孔，每孑L終量200 l，均含相同濃度 的乙醇(0．叭％)或DMSO(0．1％)。① 不同濃度熊果酸對LN— CaP、DU145細胞生長變化的影響：熊果酸按濃度倍比稀釋法設 8個濃度(0、2．5、5．0、10、20、40、80、160 g／m1)。實驗分為三 組：LNCaPR組：正常雄激素培養(yǎng)(不含酚紅的RPMI1640—10％ 無激素FBS+0．1 nmmolfL的R1881)；DU145 R組：正常雄激素 培養(yǎng)(0．1 nmmoL／L的R1881)；DU145 F組：雄激素阻斷培養(yǎng)(培 養(yǎng)基中不含雄激素且加入1 000 nmmolfL氟他胺)，每組均加入 不同終濃度的熊果酸。②熊果酸對不同濃度雄激素時LNCaP 細胞生長的影響：根據(jù)濃度抑制曲線，以20斗g／ml作為熊果酸 的實驗濃度。實驗分兩組，R組：不同濃度R1881培養(yǎng)組(0、 0．01、0．1、1、10 nmmol／L)；R+U組：不同濃度R1881+熊果酸。③MTr法檢測：細胞培養(yǎng)24、48、72、96、120 h，于每孔內(nèi)加 MTT液(5 mg／m1)20 1，繼續(xù)培養(yǎng)4 h終止。吸棄培養(yǎng)上清，于 每孑L內(nèi)加入150 l DMSO，振蕩，使MTT結(jié)晶充分溶解。選擇 575 nm波長，于酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔的光吸收度(OD 值)。 1．4 數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計學處理：以MTT測定結(jié)果計算每孔的平均光吸收度及細胞生長抑制率，分別作出濃度一生長曲線和時 間一生長曲線，根據(jù)數(shù)據(jù)及曲線分析結(jié)果。 2 結(jié)果 2.1 不同濃度熊果酸對LNCaP及DU145細胞生長的影響：熊果酸對兩種前列腺癌細胞的生長均呈濃度及時間依賴性抑制。 20 ml濃度的熊果酸對LNCaP和DU145細胞為有效抑制濃 度，此濃度下96 h時抑制率近50％ (LNCaP)或大于50％(DU145)(圖1)。雄激素阻斷劑氟他胺對DU145細胞的生長 無明顯影響。熊果酸對DU145細胞具有濃度和時間依賴性抑制效應，熊果酸的作用后再應用氟他胺比單純熊果酸的作用要明顯，對細胞抑制率明顯上升(作用96 h后抑制率升高10％) (圖2) 2.2 熊果酸對不同濃度R1881環(huán)境下LNCaP生長的影響： LNCaP細胞的生長依賴雄激素的存在，在不同濃度的R1881環(huán) 境中LNCaP細胞的濃度生長曲線呈鐘型，0．1 nM濃度為最適 R1881生長濃度(圖3)。熊果酸(20 m1)對不同濃度R1881 環(huán)境下的LNCaP細胞均呈劑量和時間依賴性抑制，熊果酸作用后，LNCaP細胞生長曲線仍呈鐘型，但曲線頂點右移至1．0 nM 附近，最適R1881濃度上升了l0倍以上(圖4)，即雄激素激發(fā) LNCaP細胞生長的閾值明顯提高。 3 討論 熊果酸(ursolic acid)是存在于天然植物中的一種三萜類化 合物，具有調(diào)節(jié)激素平衡和脂質(zhì)代謝 J，減少炎癥因子分泌的 功能 。，體內(nèi)外能抑制多種腫瘤細胞的生長，有明顯細胞毒作用和誘導分化作用 J，對一些臨床具有內(nèi)分泌性質(zhì)的腫瘤如小 細胞肺癌、甲狀腺癌等有明顯的抑制作用[4i。PCa的形成是多 素、多基因突變的過程，內(nèi)分泌一代謝系統(tǒng)紊亂是其發(fā)病的基礎 ，去雄激素治療加重了這種紊亂是促進雄激素非依賴進 展的重要原因。熊果酸的這些生物學作用，使其對激素調(diào)節(jié)性腫瘤尤其是PCa可能會有較好的治療作用，有望通過調(diào)節(jié)甾體 激素及炎癥因子的分泌，改善PCa細胞的生長環(huán)境，誘導細胞 分化，使PCa恢復對雄激素的敏感性，從而使內(nèi)分泌治療長期有效。 熊果酸對正常培養(yǎng)的LNCaP細胞呈明顯的濃度和時間依賴性抑制效應。20 ml的濃度在96 h時對細胞的抑制率接 近50％ 。LNCaP細胞在梯度R1881濃度環(huán)境中培養(yǎng)，不同的時相點的濃度一生長曲線均呈鐘型，曲線的頂點均在0．1 nM處。 可見，正常狀況下LNCaP細胞生長的最適R1 881濃度為 0．1 nmmol／L。熊果酸對不同濃度R1881時的LNCaP細胞都有 明顯的時間依賴性抑制作用。在熊果酸作用下，LNCaP的 R1881濃度一生長曲線仍保持鐘型，但曲線的頂點右移至 1 nmmol／L或略高，即最適R1881濃度上升了10倍以上。LN— CaP細胞存在最適雄激素濃度的機制尚不清楚，有研究認為， EGFR的表達量和活性 j及E2F一1蛋白的表達變化與此有關(guān)。熊果酸作用后，LNCaP細胞生長的最適雄激素濃度上升， 對R1881的需求加大，機體內(nèi)現(xiàn)有的雄激素濃度已不足以維持癌細胞的生長，降低了癌細胞對低濃度雄激素的生存適應能 力，將會阻止或延緩雄激素非依賴性的發(fā)生。隨著熊果酸作用時間的延長，最適雄激素濃度是否會進一步上升，尚需進一步 觀察。 DU145細胞在氟他胺阻斷雄激素前后的生長曲線幾乎一致，具有明顯的不依賴雄激素生長的特性。在雄激素環(huán)境下， 熊果酸(20 rn1)在96 h時對DU145細胞的抑制率為 44．4％ 。在熊果酸作用的同時再加用氟他胺，同一時間對細胞 的抑制率上升到54．4％ ，作用時間延長，抑制率上升的幅度越 大�？梢姡芄嶙饔煤蠓纷钄嘈奂に貙U145細胞的生 長發(fā)揮了抑制作用，該現(xiàn)象提示，熊果酸在一定程度上誘發(fā)了 DU145細胞對雄激素的反應性，為AIPC的治療和研究提供了 有意義的思路，其內(nèi)在機制尚須進一步研究。 |
