高效液相色譜法測(cè)定山香圓中熊果酸含量 | 高效液相色譜法測(cè)定山香圓中熊果酸含量 |
| 發(fā)布時(shí)間:2010-08-16 信息來(lái)源:admin 發(fā)布人:admin 點(diǎn)擊次數(shù):2678 |
【摘要】 目的采用高效液相色譜(HPLC)測(cè)定山香圓中熊果酸的含量。方法色譜條件：Hypersi ODS C18色譜柱(4.6 mm×250 mm；5 μm)；流動(dòng)相為乙腈∶甲醇(體積比為68∶32)，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，流動(dòng)相流速1.0 ml/min，柱溫25℃。結(jié)果熊果酸檢測(cè)的線性范圍0.50～10.05 mg (R2=0.998 7) ，平均回收率為99.28%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.96%(n=5)。結(jié)論 該方法準(zhǔn)確、快捷、靈敏、重復(fù)性好，可作為山香圓藥材及相關(guān)制劑質(zhì)量控制的一個(gè)有效方法。 【關(guān)鍵詞】 高效液相色譜 山香圓 熊果酸 含量測(cè)定 山香圓Turpinia arguta Seen為省沽油科屬植物，別名千打捶、七寸釘、蛾子藥、蛇舌草、白花蛇舌草等，主產(chǎn)于江西、福建、廣東、廣西等省，性寒味甘苦，具有清熱解毒、利尿消腫的功效［1］。山香圓葉中主要有效成分為熊果酸、齊墩果酸、對(duì)香豆酸、肉豆蔻酸等［2～5］。熊果酸(ursolic acid, UA)又名烏索酸、烏蘇酸，是存在于天然植物中的一種三萜類(lèi)化合物(圖1)，相對(duì)分子質(zhì)量為456，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。體外對(duì)G+和G-菌及酵母菌均有抗菌活性；有抗糖尿病、抗?jié)兗敖档脱淖饔�。同時(shí)具有抗致癌、抗促癌，誘導(dǎo)F9畸胎癌細(xì)胞分化和抗血管生成作用，是一種極佳的滅毒高效新型抗癌藥物，另外還具有明顯抗氧化功能，并且對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有明顯的安定與降溫作用，因而被廣泛地用作醫(yī)藥和化妝品原料，日益受到重視［6～8］。熊果酸測(cè)定方法包括薄層掃描法［9～12］、高效液相色譜法等［13～15］。目前，關(guān)于山香圓中熊果酸含量分析方法的報(bào)道較少，僅見(jiàn)毛友昌等［11］、魏福有等［12］采用薄層色譜法對(duì)山香圓葉和山香圓含片中熊果酸含量進(jìn)行定量分析。本文建立了山香圓熊果酸含量的高效液相色譜測(cè)定法，結(jié)果表明此方法操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確性高，適用于含熊果酸藥材及其制劑的質(zhì)量控制檢測(cè)。 1 器材與方法 1.1 材料與儀器樣品：山香圓葉由南昌華依制藥有限公司提供；熊果酸對(duì)照品：購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)742.200111；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純；HP1050高效液相色譜儀，配有HP1050色譜工作站、真空脫氣機(jī)、手動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱。 圖1 熊果酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)式 1.2 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備稱取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)樣品25.125 mg，置于25 ml容量瓶瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，得含熊果酸1.005 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密移取熊果酸對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5，2，4，8，10 ml，分別置于10 ml容量瓶中。甲醇稀釋至刻度，配制成一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。 1.3 樣品溶液的制備將山香圓樣品粉碎，過(guò)60目篩，80℃干燥至恒重。精密稱取2.0 g，置索氏提取器中，用甲醇適量加熱回流提取6 h，提取液用0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾，濃縮并定容至25 ml容量瓶中，濾液作為樣品溶液。 1.4 色譜條件Hypersi ODS C18色譜柱(4.6 mm×250 mm；5 μm)；流動(dòng)相為乙腈∶甲醇(體積比為68∶32)；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；流動(dòng)相流速1.0 ml/min；柱溫為25℃；進(jìn)樣量為10 ml。 2 結(jié)果 2.1 色譜條件的選擇經(jīng)紫外光譜掃描，熊果酸的最大吸收波長(zhǎng)為210 nm。故本實(shí)驗(yàn)采用210 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。在“1.4”項(xiàng)色譜條件下，熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶液的保留時(shí)間為32 min左右，峰形良好，熊果酸與齊墩果酸分離效果良好（見(jiàn)圖2～3）。 2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取按“1.2”項(xiàng)方法制備的儲(chǔ)備液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。每個(gè)對(duì)照品儲(chǔ)備液進(jìn)樣10 μl，測(cè)定峰面積。以峰面積值(Y)為縱坐標(biāo)，其對(duì)應(yīng)進(jìn)樣質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行回歸計(jì)算，得線性方程為：Y=102.05X-0.796，R2=0.998 7。表明熊果酸的進(jìn)樣量在0.50～10.05 mg范圍內(nèi)線性良好。 2.3 精密度實(shí)驗(yàn)取熊果酸對(duì)照品溶液(0.1005 mg/ml)10 ml，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積，得其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.44%，說(shuō)明儀器的精密度良好。 2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)對(duì)同一熊果酸對(duì)照品溶液，在0，2，4，6，8，10 h各進(jìn)樣3次，10 ml/次，記錄峰面積值，其RSD為0.995%，表明樣品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。 2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)精密稱取2.0 g同一批山香圓樣品5份，按“1.3”項(xiàng)所述方法制備樣品溶液，同日內(nèi)測(cè)定5次，進(jìn)樣10 ml/次，測(cè)得峰面積的日內(nèi)精密度（以RSD計(jì)）為1.89%，表明該方法的重復(fù)性良好。 2.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密稱取已知含量的同一批次樣品5份，每份樣品約2.5 g，置于5個(gè)錐形瓶中，精密加入熊果酸對(duì)照品溶液1 ml（1.005 mg/ml）。按“1.3”項(xiàng)所述方法制備樣品溶液，得到相同濃度溶液5份。按“1.4”項(xiàng)所述色譜條件分析，計(jì)算加樣回收率，得熊果酸平均回收率為99.28%，RSD=1.96%。結(jié)果見(jiàn)表1。表1 熊果酸回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 2.7 樣品含量測(cè)定取“1.1”項(xiàng)南昌華依制藥有限公司提供的山香圓葉，按“1.3”項(xiàng)所述方法制備樣品溶液，取同一批號(hào)樣品溶液3份，在上述色譜條件下直接進(jìn)樣，10 μl/次，每個(gè)樣品進(jìn)樣3次，取平均值，按回歸方程計(jì)算得熊果酸的含量為1.025 mg/g。結(jié)果見(jiàn)表2。表2 山香圓葉中熊果酸的含量 3 討論 3.1 提取條件的選擇根據(jù)熊果酸的溶解性能，選擇甲醇、無(wú)水乙醇、醋酸乙酯、氯仿作為溶劑，對(duì)樣品進(jìn)行索氏提取處理，比較了不同提取溶劑對(duì)提取效果的影響。結(jié)果顯示采用甲醇作為溶劑提取率最高，且甲醇提取液色譜圖色譜峰分離較好，對(duì)熊果酸的測(cè)定亦無(wú)干擾。因此選用甲醇作為提取溶劑。 3.2 流動(dòng)相的選擇根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［14～16］，選擇甲醇-水（90∶10）、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-水（75∶25），甲醇-乙腈-水（64∶20∶16）、甲醇-乙腈（68∶32）等不同流動(dòng)相進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明甲醇-乙腈（68∶32）作為流動(dòng)相可得到分散度好的色譜峰，供式品中熊果酸與齊墩果酸的分離度也較高。 采用高效液相色譜法對(duì)熊果酸含量進(jìn)行分析，對(duì)色譜條件進(jìn)行優(yōu)化選擇，在最佳條件下測(cè)定熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品，作標(biāo)準(zhǔn)曲線并對(duì)提取的熊果酸樣品進(jìn)行了含量測(cè)定。分析結(jié)果表明，此法簡(jiǎn)單快速、高效靈敏、重復(fù)性好,可用于含熊果酸藥材及其制劑的質(zhì)量控制。
【參考文獻(xiàn)】
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