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【摘要】  探討熊果酸對人肺癌裸鼠移植瘤的抑制作用及其機制。方法:采用人肺腺癌A549細胞株進行裸鼠移植瘤實驗。通過移植瘤生長曲線、終末瘤重計算抑制率觀察熊果酸對人肺癌裸鼠移植瘤的抑制作用，采用免疫組化法檢測VEGF蛋白表達、微血管密度，TUNEL檢測凋亡指數(shù)，探討其作用機制。結(jié)果:實驗組用藥后移植瘤生長緩慢，實驗結(jié)束時，實驗組瘤重及瘤體積明顯低于對照組（P＜0.05），抑瘤率為51.35％。實驗組移植瘤組織微血管密度及VEGF蛋白表達明顯低于對照組（P均＜0.01），實驗組癌細胞凋亡指數(shù)高于對照組(P＜0.01)。結(jié)論:熊果酸對裸鼠肺腺癌移植瘤生長有抑制作用，其機制可能與降低移植瘤促血管生成因子VEGF的表達、抑制新生血管的形成和促進腫瘤細胞凋亡有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】  肺腫瘤 細胞凋亡 血管生成 熊果酸

    ［ABSTRACT］  Objective： To study the inhibitory effect of ursolic acid on the transplanted human lung adenocarcinoma cell line A549 in nude mice and explore its mechanism. Methods： The nude mice bearing  A549 cancer cells were established in vivo. The transplanted tumor growth curve was drawn, and the inhibitive ratio was calculated according to tumor weight. Immunohistochemistry (S�睵)was used to examine the expression of VEGF and MVD of the transplanted tumor, and TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase mediated UTP nick end labeling) was used to examine the apoptosis index of the transplanted tumor. Results： The transplanted tumor of the treated group grew slowly. The volume and the weight of tumors in the  treated group were smaller than those in the control group. The tumor inhibitive rate was 51.35％. The expressions of VEGF and MVD in the treated group were lower than those of the control group, and the apoptosis index of the transplanted tumor in the treated group was higher than that in the control group(P＜0.01). Conclusion： Ursolic acid  has an anti�瞐ngiogenesis activity on the human lung adenocarcinoma cell line A549 in vivo by inducing the  apoptosis of the  cancer cells, deceasing the VEGF expression and inhibiting the vasoformation of the transplanted tumor.

    ［KEY WORDS］  Lung cancer； Apoptosis； Angiogenesis； Ursolic acid    熊果酸（ursolic acid），又名烏索酸，屬于α�蚕銟渲�醇型五環(huán)三萜類化合物，有廣泛的生物學效應(yīng)和藥理活性。近年研究表明，熊果酸不僅對多種致癌、促癌物質(zhì)有抵抗作用，而且在體外能抑制多種腫瘤細胞的生長［1］，并可抑制血管內(nèi)皮細胞（VEC）的活化、增殖、遷移，具有抑制血管形成的作用［2］。本研 究探討熊果酸體內(nèi)對人肺癌裸鼠移植瘤的抑制作用，通過檢測移植瘤細胞的凋亡、組織中微血管密度及VEGF蛋白表達，觀察其對瘤組織血管形成和細胞凋亡的影響，對其作用機制進行初步探討。

    1  材料與方法

    1.1  細胞株與細胞培養(yǎng)  人肺腺癌A549細胞株由山東省醫(yī)學科學院基礎(chǔ)所惠贈，培養(yǎng)在含10％小牛血清、青霉素及鏈霉素各100?U/ml的RPMI��1640培養(yǎng)液中，37?℃、5％CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，0.25％胰蛋白酶消化傳代。

    1.2  實驗動物與試劑  BALB/C(nu/nu)裸小鼠購自北京維通利華實驗動物有限公司，12只，SPF級，鼠齡3 4周，體重17 20?g，雄性，飼養(yǎng)于超凈生物層流架內(nèi)，環(huán)境定期紫外線消毒，保持恒溫（25±2）℃、恒濕（45％ 50％），籠具、飲水均經(jīng)高壓蒸汽滅菌，實驗操作均在無菌罩內(nèi)進行。熊果酸純品購自Sigma公司；血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）鼠單克隆抗體、CD34鼠單克隆抗體、羊抗鼠、羊抗兔IgG�睭RP、SP試劑盒、TUNEL 試劑盒、DAB均購自北京中山生物技術(shù)有限公司。

    1.3  方法

    1.3.1  熊果酸對裸鼠肺癌移植瘤的抑制作用  將A549細胞按常規(guī)方法復蘇擴增，消化后無血清培養(yǎng)液離心洗滌2次，計數(shù)并調(diào)整細胞濃度為5×106個/ml，臺盼藍染色活細胞計數(shù)＞99％。用帶6號針頭注射器抽取癌細胞懸液接種于裸鼠右前腋部皮下，每個部位接種0.2?ml，成瘤后隨機分為實驗組和對照組，每組6只。實驗組給予熊果酸50?mg/(kg·d)溶于0.2?ml生理鹽水，對照組給生理鹽水0.2?ml/d，均行腹腔注射，1次/d，連續(xù)治療20?d。實驗中注意觀察裸鼠精神、進食、排便及體重情況。隔天用游標卡尺測量腫瘤長徑a和短徑b，按公式V=0.5×a×b2計算移植瘤體積，繪制生長抑制曲線。最后1次用藥24?h后以脫頸方式處死裸鼠，剝出腫瘤，計算各組平均瘤重及抑瘤率（Inhibit Rate，IR）。

    IR＝〔（對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重）/對照組平均瘤重〕×100％。

    1.3.2  病理學檢查  對裸鼠進行解剖，肉眼觀察重要臟器及淋巴結(jié)情況，取腫瘤及重要器官組織以10％福爾馬林固定、石蠟包埋切片， HE染色，光鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)變化。

    1.3.3  免疫組化法檢測移植瘤VEGF蛋白表達和微血管密度計數(shù)  免疫組化染色采用鏈霉菌素－生物素（S�睵）免疫組化技術(shù)， 移植瘤石臘標本4?μm切片2張，常規(guī)脫臘，組織抗原修復采用微波抗原修復法，VEGF和CD34一抗工作濃度均為1∶50，具體染色步驟按照試劑盒說明書操作，將已知的乳腺癌陽性切片作陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。

    VEGF蛋白的陽性表達為癌細胞質(zhì)或細胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。按照Breasalier［3］的方法判斷染色結(jié)果，根據(jù)細胞染色強度分為4級，并分別記分：細胞無著色為陰性（0分）；著淺黃色為弱陽性（1分）；著棕黃色為中度陽性（2分）；著棕褐色為強陽性（3分）。在每張切片上隨機選取10個視野（10×10），計數(shù)每一強度視野數(shù)所占的比率（F），根據(jù)下列公式計算每張切片的平均染色強度（intensity score，IS）。IS＝Σ［(0×F0)+(1×F1)+(2×F2)+(3×F3)］,F=10×視野％。

    微血管密度（MVD）的判斷以CD34標記微血管，計算瘤內(nèi)著色的毛細血管和微小血管。按照Weidner［4］的評判標準，凡呈現(xiàn)棕色單個內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞簇均作為1個血管計。低倍鏡下選擇微血管最密集的3個視野，在高倍鏡視野范圍內(nèi)，計數(shù)所有的染色微血管數(shù)，取3個視野計數(shù)結(jié)果的均數(shù)為該切片的微血管數(shù)。

    1.3.4  原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標記法（TUNEL）法檢測移植瘤的細胞凋亡  移植瘤石蠟切片常規(guī)脫蠟，操作步驟按照試劑盒說明書進行，蘇木素復染細胞核。將已知的陽性切片作陽性對照，以不含末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶的標記液處理的切片作陰性對照。細胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞，隨機選10個視野，每個視野觀察100個細胞，計數(shù)陽性細胞數(shù)，計算凋亡指數(shù)（apoptotic Index， AI）。AI(％)＝陽性細胞計數(shù)/觀察細胞總數(shù)×100％。

    1.4  統(tǒng)計學處理  數(shù)據(jù)處理采用SPSS10.0 for windows軟件包，組間差異選用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2  結(jié)  果

    2.1  熊果酸抑制裸鼠移植瘤的生長及抑瘤率  兩組裸鼠移植瘤的生長曲線見圖1。實驗組在用藥6?d后出現(xiàn)生長抑制，移植瘤體積增長緩慢。實驗結(jié)束時，兩組裸鼠的鼠重、瘤重、瘤體積見表1。由表1可見，兩組裸鼠的體重無明顯差別，與實驗前比較有增長但改變不明顯，治療結(jié)束時治療組移植瘤的瘤重及體積明顯低于對照組（P＜0.05），抑瘤率為51.35％。肉眼觀察各組裸鼠重要臟器及淋巴結(jié)未見明顯的轉(zhuǎn)移病灶，但對照組移植瘤均不同程度的侵犯右前肢肌肉組織，且瘤體表面微血管豐富。而實驗組均無上述表現(xiàn)。實驗組裸鼠心、肝、腎、肺、腦等組織切片HE染色均未見病理性改變。實驗組裸鼠一般情況均無明顯變化，未觀察到藥物相關(guān)性副作用，如活動遲緩、腹瀉、厭食、精神萎靡等癥狀。對照組移植瘤HE染色切片顯示癌細胞密集，呈團塊狀分布，有明顯的異質(zhì)性，核大深染，核仁明顯，胞漿豐富，可見較多核分裂像與微血管形成，間質(zhì)極少。而實驗組癌細胞排列較稀疏，呈不同程度的退行性變，核深染固縮，核漿比例減少，可見大片無結(jié)構(gòu)的壞死區(qū)，核分裂像與微血管形成較少。圖1  兩組裸鼠移植瘤的生長曲線

    2.2  移植瘤組織內(nèi)的VEGF蛋白表達和微血管密度計數(shù)  VEGF陽性表達位于癌細胞的細胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色顆粒，細胞膜也可見弱表達，CD34標記血管內(nèi)皮細胞，內(nèi)皮細胞被染成棕黃色，兩組移植瘤組織均有陽性表達，有的形成管腔，有的為單個內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞簇。腫瘤邊緣組織的MVD高于瘤中央。實驗組VEGF表達和MVD均明顯低于對照組(P均＜0.01)，見表2。nVEGFMVD計數(shù)對照組62.6±0.3242.1±3.9實驗組617.1±2.2*

   3  討  論

    據(jù)不完全統(tǒng)計，熊果酸以游離形式或與糖結(jié)合形式分布于大約34個科46個屬的108種植物中。熊果酸具有廣泛的生物效應(yīng)，體外實驗表明，熊果酸具有多種抗腫瘤活性［5］。本實驗通過人肺癌A549細胞裸鼠移植瘤，觀察熊果酸的體內(nèi)抗肺癌作用，結(jié)果顯示，用藥后實驗組移植瘤生長速度明顯低于對照組，治療結(jié)束時實驗組瘤重及瘤體積明顯低于對照組（P＜0.05），抑瘤率為51.35％。表明熊果酸可以抑制肺癌移植瘤的生長。實驗結(jié)束時，實驗組裸鼠心、肝、腎、肺、腦組織HE染色切片顯示組織結(jié)構(gòu)正常，未見異常病灶，而實驗組裸鼠也未發(fā)現(xiàn)其它藥物相關(guān)不良反應(yīng)，表明其抗肺癌作用時對機體無明顯的毒副作用。

    為進一步探討熊果酸抗肺癌機制，我們檢測了兩組移植瘤組織內(nèi)的VEGF蛋白表達和微血管密度計數(shù)以及癌細胞的凋亡指數(shù)。結(jié)果顯示，實驗組VEGF表達和MVD均明顯低于對照組（P ＜0.01）。實驗組移植瘤組織AI為12.3±1.2，對照組AI僅為2.3±2.1，兩者比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。表明熊果酸可以抑制移植瘤組織的血管形成，誘導腫瘤細胞凋亡。

    腫瘤組織的新生血管形成在腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移中起著重要作用。在腫瘤細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中，因微環(huán)境改變（缺氧、pH值下降、NO升高）、突變型p53、ras等基因上調(diào)VEGF等血管生成因子以及腫瘤細胞與內(nèi)皮細胞雙向旁分泌作用（相互釋放促生長因子），則啟動腫瘤細胞的血管生成開關(guān)，激活血管生成因子，促進內(nèi)皮細胞增殖、遷移，形成血管芽及微血管，同時也激活基質(zhì)金屬蛋白酶活性，使細胞外基質(zhì)降解，利于血管形成、延伸及腫瘤生長、浸潤和轉(zhuǎn)移。而VEGF是目前所知最強的、直接作用于血管內(nèi)皮細胞的血管生成促進因子。Sohn等［6］以雞胚胎絨毛膜實驗?zāi)Ｐ瓦M行研究，結(jié)果顯示，熊果酸具有較強的血管生成抑制作用，并有劑量依賴性。本研究結(jié)果顯示，熊果酸明顯降低移植瘤的VEGF表達和微血管密度，表明它可以在體內(nèi)抑制肺癌血管生成，從而抑制肺癌增殖，證明熊果酸是有效的肺癌血管抑制劑，而其抑制血管生成的機制與下調(diào)移植瘤VEGF表達有關(guān)�？寡�管生成可能是熊果酸抗肺癌的機制之一。

    細胞凋亡是受基因調(diào)控的一種主動性細胞自殺過程，具有獨特的生化和形態(tài)特征。對腫瘤生長起著負調(diào)控作用，是抗腫瘤的重要途徑。Kim等［7］的研究顯示，熊果酸使p21WAFI表達增加，導致細胞色素C釋放和caspase��3激活，抑制DNA復制，從而導致肝癌HepG2細胞凋亡和細胞周期終止。Harmand等［8］在對HaCat細胞的研究中也得到同樣的結(jié)論，推測熊果酸誘導的細胞周期停滯可能是由p21WAFI起作用，同時使392位的絲氨酸磷酸化易位到核內(nèi)，使p53獲得抗腫瘤活性。我們運用TUNEL法檢測移植瘤組織的凋亡指數(shù)，結(jié)果表明，實驗組移植瘤組織中癌細胞凋亡率顯著增加，提示熊果酸在體內(nèi)具有誘導肺癌細胞凋亡的作用。以此我們可以認為，誘導細胞凋亡也是熊果酸體內(nèi)抑制肺癌生長的機制之一。

【參考文獻】
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［3］ Breasalier RS, HO SB, Schoeppner HL, et al. Enhanced sialylation of mucin associated carbohydrate structures in human colon cancer metastasis［J］. Gastroenterology, 1996, 110(5):1?354��1?367.

［4］ Weidner N, Semple JP, Welch WR, et al. Tumor angiogenesis and metastasis correlation in invasive breast carcinoma［J］. New Eng J Med, 1991, 324(1):1��8.

［5］ 夏國毫.熊果酸抗腫瘤作用研究進展［J］.國外醫(yī)學腫瘤學分冊，2002，29（6）：420��422.

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［7］ Kim DK, Baek JH, Kang CM, et al. Apoptotic activity of Ursolic acid may correlate with the inhibition of initiation of DNA［J］. Int J Cancer, 2000, 87(5):629��636.

［8］ Harmand PO, Duval R, Liagre B, et al. Ursolic acid induces apoptosis through caspase��3 activation and cell cycle arrest in HaCat cells［J］. Int J Oncol, 2003, 23(1):105��112.

［9］ 熊筱娟，陳 武，李開泉，等.熊果酸毒性實驗研究［J］.宜春醫(yī)專學報，2001，13（1）：54.