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黃云,肖艷萍,李娟,林海

(湖南醫(yī)藥工業(yè)研究所,湖南　長(zhǎng)沙　410014)

[摘要] 　目的:采用HPLC法檢測(cè)不同工藝所得金銀花提取物的組分及綠原酸含量。方法:采用Symmetry ODS ( 4. 6 ×150mm, 5μm) ,ODS保護(hù)柱。流動(dòng)相為乙腈- 0. 4%磷酸(8z 92) ,檢測(cè)波長(zhǎng)為327nm。結(jié)果:液相色譜圖中只有采用改良石硫法所得提取物的組分與原石硫法基本保持一致,其它方法所得提取物的組分與原石硫法都有差別。結(jié)論:金銀花提取物組分不同,抗菌作用則不同。由此可見(jiàn)綠原酸含量的高低尚不能說(shuō)明金銀花提取物質(zhì)量的好壞。

[關(guān)鍵詞] 　金銀花提取物;綠原酸;組分;高效液相色譜法

[Abstract ] 　Objective: HPLC was used to examine the components of honeysuckle extraction obtained by different p reparationand the content of Chlorogenic acid. Method: To use the SymmetryODS(4. 6 ×150mm, 5μm) , ODS Column. Mobile phase: acetoni2 trile - 0. 4% Phosphoric (8z 92) , detective wavelength was 327nm. Result: In liquid chromatography - mass spectrometry(LC - MS) ,only have the components of extraction obtained by imp rovementmethod of SH IL IU kep t uniform with p rimary method of SH IL IU, the components of extraction obtained by otherways had different from p rimary method of SH IL IU. Conclusion: the components of honey2 suckle extraction were different, and its anti - bacteria effectwas different. So, Chlorogenic acid whatever its content was the high or low couldn’t exp lain that the quality of honeysuckle extraction was good or bad.

[ Key words ] 　Honeysuckle extraction; Chlorogenic acid; Components; HPLC

　金銀花為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb. 紅腺忍冬Lonicera confusa CD. 或毛花柱忍冬Lonicera dasystylaRehd. 的干燥花蕾或初開(kāi)的花。具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱之功效,對(duì)多種細(xì)菌及病毒均有抑制作用,并且具較強(qiáng)的抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)的作用及提高機(jī)體抵抗力的作用。所含化學(xué)成分有綠原酸、異綠原酸、揮發(fā)油、咖啡酸、黃酮化合物、三萜皂苷、木犀草素及無(wú)機(jī)元素等,綠原酸(Chlorogenic acid)是金銀花的主要藥用成分,具有顯著的清熱解毒和抗菌消炎作用。

1　儀器與試藥

1. 1　儀器　Waters高效液相色譜儀;Waters 2996二極管陣列檢測(cè)器, Empower數(shù)據(jù)處理軟件; Symmetry ODS柱( 4. 6 ×150mm, 5μm) ,ODS保護(hù)柱;大孔吸附樹(shù)脂。

1. 2　試藥　乙腈為色譜純,重蒸餾水,其他試劑均為分析純。金銀花藥材(購(gòu)自湖南省藥材公司) ;綠原酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供,批號(hào): 110753 - 200212) 。

2　實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2. 1　金銀花提取物的制備[ 1～3 ]。

2. 1. 1　石硫法　取金銀花1kg,加水煎煮2次,每次2h,合并煎煮液,濾過(guò),濾液加入石灰乳調(diào)pH值10～12,靜置,濾出沉淀,加水適量,用硫酸調(diào)pH值6～7,攪勻,濾過(guò),濾液濃縮至稠膏狀,噴霧干燥,即得干膏。

2. 1. 2　改良石硫法　取金銀花1kg,加(15、10)倍量的水, 80～90℃提取2次,每次2h,濾過(guò),合并濾液,濾液濃縮至原體積的2 /5后,加入20%的石灰乳調(diào)pH值10～12,靜置12h,濾出沉淀,加2倍量95%乙醇混懸,加50%硫酸調(diào)pH值3～4,混勻,濾過(guò),濾液用40%NaOH調(diào)pH值6～7,過(guò)濾,濃縮至稠膏狀,噴霧干燥,即得干膏。

2. 1. 3　超濾法處理[ 1 ] 　取金銀花1kg,加( 15、10 )倍量的水,煎煮2次,每次2h,濾過(guò),合并濾液,濾液濃縮至原體積的2 /5后,靜置,濾過(guò),超濾,收集超濾液,濃縮至生藥量,靜置,

濾過(guò),減壓濃縮,真空干燥得干膏。

2. 1. 4　乙醇回流提取[ 1 ] 　稱(chēng)取金銀花1kg,置圓底燒瓶中,加(10、8)倍量70%乙醇,加熱回流提取2次,每次2h,過(guò)濾,濾液合并,減壓濃縮,真空干燥得干膏。

2. 1. 5　大孔吸附樹(shù)脂處理[ 2 ] 　取金銀花1kg,加(15、10)倍量的水, 90℃提取2次,每次2h,濾過(guò),合并濾液,濾液加至已預(yù)處理的大孔吸附樹(shù)脂上,加水洗脫,收集洗脫液,減壓濃縮,真空干燥得干膏。

2. 2 　色譜條件的選擇　色譜柱: Symmetry ODS柱( 4. 6 ×150mm, 5μm) ,ODS保護(hù)柱。流動(dòng)相:乙腈- 0. 4%磷酸(8：92) 。檢測(cè)波長(zhǎng)為327nm。流速: 1. 0ml/min。柱溫: 40℃。理論板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2. 3　干擾試驗(yàn)　按照上述色譜條件,分別精密吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液各10μl,注入色譜儀,記錄色譜圖,供試品色譜中,在與對(duì)照品色譜圖相應(yīng)的位置上有一相同的色譜峰,而陰性對(duì)照色譜在與對(duì)照品色譜圖相應(yīng)的位置上無(wú)峰,表明陰性沒(méi)有干擾。

2. 4　對(duì)照品溶液的制備　精密稱(chēng)取在五氧化二磷中干燥48h的綠原酸對(duì)照品適量,加50%甲醇溶解,制成每1ml含綠原酸50μg的溶液,即得。

2. 5　供試品溶液的制備　取金銀花提取物約0. 1g,研細(xì),精密稱(chēng)定, 置50ml棕色量瓶中, 加50%甲醇約30ml, 超聲(120W 40KHZ )處理20min,使溶解,放置至室溫,加50%甲醇稀釋至刻度,搖勻,過(guò)濾,精密量取續(xù)濾液1ml至5ml棕色量瓶中,加50%甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得。

2. 6　線性關(guān)系的考察　分別精密吸取濃度為52. 5μg/ml的綠原酸對(duì)照品溶液6、8、10、12、14μl,注入液相色譜儀,按上述色譜條件測(cè)定峰面積。以綠原酸對(duì)照品進(jìn)樣量X ( ng)為橫坐標(biāo),綠原酸峰面積積分值Y為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程: Y = 2. 57 ×103X + 2. 36 ×104 , r = 0. 9994。

2. 7　精密度試驗(yàn)　精密吸取同一濃度的對(duì)照品溶液10μl,重復(fù)進(jìn)樣5次,測(cè)定其峰面積積分值,結(jié)果RSD = 0. 1%。

2. 8　穩(wěn)定性試驗(yàn)　分別精密吸取同一供試液10μl于0、1、2、4、8、24h進(jìn)樣,測(cè)定其綠原酸峰面積積分值。結(jié)果表明,供試品溶液在24h內(nèi)峰面積積分值基本穩(wěn)定, RSD = 0. 23%。

2. 9　加樣回收率試驗(yàn)　取已知綠原酸含量( 7. 49% )的,每份0. 10g左右,共5份,精密稱(chēng)重。置棕色容量瓶中,分別按(1： 1) 精密加入綠原酸對(duì)照品,按供試品溶液的制備方法制備,按上述色譜條件操作,測(cè)定綠原酸峰面積積分值,計(jì)算回收率,結(jié)果平均回收率為103. 0% , RSD為1. 28%。

2. 10　金銀花提取物含量測(cè)定　按照擬定的含量測(cè)定方法,按上述色譜條件操作,記錄色譜圖(見(jiàn)圖1～6) ,測(cè)定金銀花提取物中綠原酸的含量。(見(jiàn)附表)

 3　討　　論

采用乙醇提取、超濾法處理、大孔吸附樹(shù)脂處理、改良石硫法提取方法所得金銀花提取物與原石硫法相比,綠原酸的轉(zhuǎn)移率和含量都有了很大的提高。而采用乙醇提取、超濾法處理、大孔吸附樹(shù)脂3種方法處理的提取物中綠原酸含量提高得更多,但它們的組分均發(fā)生了改變,與原石硫法有差別。液相色譜中,綠原酸色譜峰前,石硫法有的幾個(gè)峰,提取物中有的消失了,有的下降了很多,且藥理作用顯示上述3種提取物的抗菌作用沒(méi)有石硫法強(qiáng)[ 3 ] ,只有采用改良石硫法所得提取物的液相色譜圖與原石硫法組分基本保持一致。由此可見(jiàn),綠原酸含量的高低尚不能說(shuō)明金銀花提取物的質(zhì)量好壞。

參考文獻(xiàn):

[ 1 ]李志華,許讓翻. 不同提取工藝對(duì)金銀花中綠原酸提取率的影響[ J ]. 中草藥, 2002, 33 (8) : 714

[ 2 ]高春榮,胡錦蓉,孫君社. 金銀花中綠原酸的提取工藝[ J ]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2003, 8 (4) : 5

[ 3 ]何偉,欒躍芳. 金銀花提取工藝的研究[ J ]. 山東醫(yī)藥工業(yè), 2003, 22 (2) : 3