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嚴(yán)贊開( 韓山師范學(xué)院化學(xué)系, 廣東潮州521041)

摘要綜述了二氫楊梅素的分離研究進展, 為深入研究二氫楊梅素的提取及純化工作提供參考。

關(guān)鍵詞二氫楊梅素; 提取; 純化

Research Progress onthe Methods of Isolation of Dihydromyricetin

YAN Zan-kai ( Department of Chemistry ,Hanshan Normal College ,Chaozhou,Guangdong 521041)

Abstract Research progress onthe method of isolationof dihydromyricetin was summarized , which will provide references for further study of extraction and purification of dihydromyricetin.

Key words Eihydromyricetin ; Extraction; Purification

二氫楊梅素( 3 ,5 ,7 ,3’,4’,5’- 六羥基-2 ,3- 雙氫黃酮醇,Dihydromyricetin,DMY) 是一種多羥基雙氫黃酮醇, 又稱蛇葡萄素。該化合物除具有黃酮類化合物的普通特性之外, 在解除醇中毒、抗高血壓、抑制體外血小板聚集和體內(nèi)血栓的形成、降低血脂和血糖水平、提高SOD 活性以及保肝護肝等方面具有特殊功效[ 1 - 2] 。據(jù)《植物藥有效成分手冊》記載, 該化合物存在于楊梅科、杜娟科、藤黃科和大戟科等植物中[ 3] , 但由于在以上植物中含量較低, 一直無法進行大規(guī)模的應(yīng)用和實驗。周天達等從顯齒蛇葡萄的幼嫩莖葉中首次分離得到二氫楊梅素, 并測定出蛇葡萄幼葉中二氫楊梅素的含量高達30 %以上, 二氫楊梅素的研究才引起人們極大的關(guān)注和重視[ 4 - 9] 。隨著二氫楊梅素研究工作的不斷深入, 其顯著的藥理活性及抗氧化活性已成為黃酮類化合物的研究熱點之一。

目前, 在我國的江西、湖南、湖北及四川等省均已建立了萬畝以上規(guī)模的蛇葡萄( 俗名藤茶) 種植基地, 為開發(fā)和利用好這一寶貴資源, 筆者將近年來國內(nèi)外二氫楊梅素的提取及純化方法作簡要概述。

1 提取方法

黃酮類化合物的提取工藝, 主要包括有機溶劑提取、熱水提取、堿液提取、超濾法提取、超聲技術(shù)提取、微波技術(shù)提取和超臨界流體萃取法提取等[ 10] 。二氫楊梅素屬多羥基黃酮類化合物, 具有很強的極性, 易溶于水、乙醇中, 運用水和乙醇來提取二氫楊梅素最為廣泛。從蛇葡萄中提取二氫楊梅素主要有采用熱水、乙醇萃取及微波輔助萃取等方法[ 11] 。

1 .1 溶劑萃取

1 .1.1 熱 水萃取。張友勝等運用重量法測定了二氫楊梅素在不同溫度下在水中的溶解度, 結(jié)果表明, 隨著水溫的上升,二氫楊梅素在水中的溶解度逐漸增大, 其中在室溫( 23 ℃) 和沸水( 100 ℃) 下二氫楊梅素的溶解度分別為0 .187 6 和1 .505 0 g/ 100 ml , 運用沸水提取二氫楊梅素效率較高[ 11] 。李衛(wèi)等以水為溶劑, 運用逆流法提取二氫楊梅素, 提取效率隨溫度升高而增加, 隨pH 值的增大略有增加, 但堿性太強易導(dǎo)致二氫楊梅素開環(huán), 在pH 值為8 ～9 的沸水中提取較為適宜; 當(dāng)固液量比為1∶10 , 沸水提取60 min, 冷卻后結(jié)晶, 提取效率為11 .00%[ 12] 。覃潔萍等用沸水回流提取, 濃縮后析出黃色結(jié)晶, 用丙酮重結(jié)晶, 得白色結(jié)晶, 提取效率為19 .60 %[ 13 - 14] 。

1 .1 .2 乙醇萃取。有機溶劑提取黃酮類化合物, 常用的溶劑有甲醇水溶液、乙醇水溶液、丙酮水溶液和乙酸乙酯等, 考慮到食用及藥用的安全性, 乙醇水溶液作為提取劑較為普遍。王巖等以乙醇為溶劑, 對乙醇濃度、乙醇用量、提取時間和提取次數(shù)4 個因素, 采用L9( 34) 正交試驗設(shè)計, 得到最佳提取工藝為:80 % 乙醇為溶劑, 乙醇用量為藥材量的10 倍, 加熱回流2 次, 每次60 min, 提取效率為8 .98 %[ 15] 。筆者等比較了水、不同濃度乙醇、氫氧化鈣飽和溶液等浸提劑的提取效率, 篩選出50% 乙醇為最佳提取劑; 并選取乙醇的濃度、提取時間、料液比3 因素3 水平進行正交試驗, 得到最佳的提取工藝條件為: 以50% 乙醇為提取劑, 按45 倍蛇葡萄干葉的量加入50% 乙醇, 保溫回流2 h, 提取平均效率為17 .80%[ 16] 。鄭成等采用乙醇浸泡進行預(yù)處理, 以水為溶劑提取二氫楊梅素, 通過先單因素分析, 后正交設(shè)計試驗, 確定了最佳提取工藝條件為: 按蛇葡萄干葉8 倍的量加入95 % 乙醇, 冷浸15 h 后, 再加入固樣量20 倍的沸水, 保溫回流30 min, 二氫楊梅素的提取率為34 .23%[ 17] 。

1 .2 微波輔助萃取微波萃取法是利用在微波場中, 吸收微波能力的差異使得基體物質(zhì)的某些區(qū)域或萃取體系中的某些組分被選擇性加熱, 從而使得被萃取物質(zhì)從基體或體系中分離, 進入到介電常數(shù)較小、微波吸收能力相對差的萃取劑中。利用微波輔助浸提, 一般1 次只要數(shù)分鐘的時間即可達到傳統(tǒng)浸提數(shù)小時的效果, 可以避免長時間高溫引起物質(zhì)的分解, 特別適合于處理熱敏性組分或從天然物質(zhì)中提取有效成分, 是一種具有良好發(fā)展前景的萃取分離方法。楊鈴等采用微波輻射萃取, 選定浸提的固液比、微波萃取溫度和微波輻射時間等為主要影響因素, 每種因素選擇3個水平, 采用L9( 33) 正交試驗設(shè)計, 結(jié)果表明, 以水為提取劑, 在95 ℃下、微波輻射15 min、料液比為1∶20 時, 二氫楊梅素的提取率為26 .70 %[ 18 - 19] 。鄭成等系統(tǒng)地研究了二氫楊梅素的微波輔助提取方法, 所得的最佳提取工藝條件為: 以水為提取劑, 微波照射時間為20 min, 加熱時間50 min, 料液比為1∶10 時, 二氫楊梅素的提取率為25 .11%[ 20 - 22] 。

1 .3 超聲波輔助萃取超聲波提取技術(shù)是以超聲波輻射壓強產(chǎn)生的騷動效應(yīng)、空化效應(yīng)和熱效應(yīng), 引起機械攪拌、加速擴散溶解的一種新型提取方法。該方法能夠更有效地提高有效部位提取率, 瞬間穩(wěn)定升高溫度對熱不穩(wěn)定成分影響較小。姚茂君等對顯齒蛇葡萄中二氫楊梅素的超聲輔助提取工藝進行了研究, 在單因素試驗和正交試驗的基礎(chǔ)上, 得出超聲波法輔助溶劑提取顯齒蛇葡萄中二氫楊梅素的最佳工藝條件為: 以65 % 乙醇溶液為提取劑, 在40 ℃ 下、料液比1∶15 、超聲波輔助提取40 min 時, 二氫楊梅素的提取率達19 .30 %[ 23] 。

1 .4 超臨界萃取超臨界流體萃取是控制超臨界流體在高于臨界溫度和臨界壓力的條件下, 從目標(biāo)物中萃取成分, 當(dāng)恢復(fù)到常壓和常溫時, 溶解在超臨界流體中的成分立即與氣態(tài)的超臨界流體分開。由于其介質(zhì)通常為無毒的CO2 , 對產(chǎn)品沒有毒, 特別適合于醫(yī)藥、食品添加劑等產(chǎn)品的提取。沈露等采用CO2 超臨界流體萃取技術(shù), 對顯齒蛇葡萄中二氫楊梅素的提取進行了研究, 通過正交試驗確定二氫楊梅素的最佳提取條件為: 萃取壓力25 MPa 、萃取溫度50 ℃、萃取時間1 .5 h、CO2 流量為20 L/ h 時, 萃取得率為15 .40 % , 純度85 .5 %[ 24] 。

2 純化方法

2 .1 重結(jié)晶法重結(jié)晶是利用固體混合物中目標(biāo)組分在某種溶劑中溶解度隨溫度變化的明顯差異, 在較高溫度下溶解度大, 降低溫度時溶解度小, 從而實現(xiàn)分離提純。二氫楊梅素是極性化合物, 在其水提物中, 不可避免地含有單寧質(zhì)、蛋白質(zhì)、糖類、鹽類以及色素等雜質(zhì), 這些雜質(zhì)以結(jié)合態(tài)或游離態(tài)形式與二氫楊梅素共存, 需經(jīng)過多次重結(jié)晶除去雜質(zhì)。二氫楊梅素在熱水中的溶解量約為在冷水中的30 倍, 而且采用水加熱重結(jié)晶提純法具有操作簡便、安全、廉價的特點。高建華等經(jīng)反復(fù)5 次熱溶重結(jié)晶, 粗提取物單寧質(zhì)由原來的1 .60% 減少到0 .26 % , 二氫楊梅素的含量從51 .00% ～86 .00 % 增加到96 .50% 以上, 結(jié)晶體呈淡黃色, 無苦澀味, 微甘, 重結(jié)晶得率為42 .30 %。筆者等采用雙溶劑法重結(jié)晶, 用38 倍的無水乙醇溶解粗提物, 用少量活性炭脫色, 趁熱過濾后蒸出大部分乙醇, 將殘留液倒入4 倍的水中, 陳化結(jié)晶, 經(jīng)2 次重結(jié)晶, 二氫楊梅素的含量從50 .00% 提升到90 .00 % 以上 。

2 .2 層析分離法層析分離法是基于樣品組分在互不相溶的“兩相”溶劑之間的分配系數(shù)不同而分離, 因而層析技術(shù)又分為凝膠色譜、吸附樹脂和離子交換樹脂技術(shù)、高效液相色譜制備技術(shù)以及逆流色譜制備技術(shù)等。

2 .2.1 吸 附樹脂法。大孔樹脂吸附分離技術(shù)是利用一類有機高聚物吸附劑, 有選擇地吸附有效成分, 再經(jīng)洗脫回收, 除掉雜質(zhì)的一種純化精制的方法。張友勝等采用大孔吸附樹脂D- 16 ( 非極性, 粒徑范圍為0 .30 ～1 .25 mm) , 運用“增溫溶解保溫過柱, 溫水解吸”的方法純化二氫楊梅素, 可將80 .00 %二氫楊梅素純化達到90 .00% , 進一步利用重結(jié)晶可以制備純度達95 .00% 以上的二氫楊梅素 。甘春麗等用乙醇∶乙醚( 1∶2) 混合溶液溶解粗提物, 與聚酰胺拌樣, 待溶劑完全揮干后, 加到預(yù)處理過的聚酰胺柱, 依次用水,20 % 、30% 、40 % 、50 % 、70% 和95 % 乙醇梯度洗脫得二氫楊梅素純品[ 29] 。

2 .2.2 硅 膠色譜法。普通柱層析是利用硅膠或氧化鋁等常用的吸附材料作為固定相, 以單組分或多組分有機溶劑作為流動相對樣品進行洗脫, 最終達到成分分離的效果。這種方法操作簡單, 但對于成分比較復(fù)雜或結(jié)構(gòu)相近的成分來說,常常得不到理想的分離效果。何桂霞等用硅膠G-CMC-Na 為固定相( 105 ℃活化0 .5 h) , 以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸( 10∶8∶5)為展開劑, 用3% FeCl 3 乙醇溶液噴霧顯色, 分離出二氫楊梅素純品[ 30] 。

2 .2.3 高 效液相色譜法。高效液相色譜分離技術(shù)是將流動相由高壓泵打入系統(tǒng), 樣品溶液經(jīng)進樣器進入流動相, 被流動相載入色譜柱( 固定相) 內(nèi), 由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù), 在兩相中作相對運動時, 經(jīng)過反復(fù)多次吸附一解吸的分配過程, 各組分在移動速度上產(chǎn)生較大的差別, 被分離成單個組分依次從柱內(nèi)流出, 達到組分分離的目的。高效液相色譜分離技術(shù)具有分離速度快、效率高的優(yōu)點。何桂霞等用Novapak C18 色譜柱( 150 .0 mm×4 .6 mm,5 μm) , 甲醇∶水∶磷酸( 27 .0∶73 .0∶0 .1) 為流動相, 流速為1 .0ml / min; 進樣量20 μl , 柱溫25 ℃, 保留時間為9 .56 min , 分離得到二氫楊梅素純品[ 31] 。

2 .2.4 高 效逆流色譜法。高效逆流色譜分離技術(shù)是運用動態(tài)液一液分配原理, 利用螺旋管的方向性與高速行星式運動相結(jié)合, 使兩相互不混溶的溶劑在螺旋管中實現(xiàn)高效接觸、混合、分配和傳遞, 從而將具有不同分配比的樣品組分分離出來。與其他液相色譜分離技術(shù)相比, 該技術(shù)不使用固相載體作為固定相, 樣品在互不相溶的兩相中分配, 克服了固相載體帶來的樣品吸附、損失和污染等缺點, 并能重復(fù)進樣, 應(yīng)用價值較高。張友勝等用Hyper ODS2 C18 高效液相色譜柱( 250 .0 mm×4 .6 mm,5 μm) , 乙腈∶水∶醋酸( 10 .0∶90 .0∶0 .1) 為流動相, 流速為1 .0 ml / min ; 進樣量20 μl , 柱溫35 ℃, 能有效地將80 .00% 粗產(chǎn)品純化至90 .00 % 以上。

3 小結(jié)

( 1) 提取方法。二氫楊梅素分子具有很強的極性, 采用水、乙醇均有良好的萃取作用, 無極性的CO2 超臨界萃取則效率不高, 因此可選用水、乙醇水溶液作萃取劑。乙醇溶劑法萃取, 雖然效率會略比水高, 但需要回收溶劑, 增加生產(chǎn)成本, 工業(yè)生產(chǎn)用水作萃取劑較好; 用水作萃取劑, 用輔助微波裝置, 可獲得很高的萃取效率, 是工業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展方向。鄭成等以干藤茶葉為原料, 研究了二氫楊梅素規(guī)模微波提取的工藝, 通過正交試驗確定最佳的提取工藝條件, 提取率高達28 .78 %[ 33] 。

( 2) 純化方法。以二氫楊梅素粗提物為原料, 純化二氫楊梅素可根據(jù)純度要求選擇純化方法。重結(jié)晶法和吸附樹脂法的特點是單次處理的樣品量較大, 所得二氫楊梅素的含量一般可達90 .00 % 以上; 與吸附樹脂法相比, 重結(jié)晶法操作簡便、成本低, 工業(yè)化生產(chǎn)優(yōu)勢明顯。高效液相色譜及高效逆流色譜分離的特點是速度快、產(chǎn)品的純度高, 但單次分離的樣品量少, 可用于科學(xué)研究小量高純樣品的制備。近期張友勝等采用GS10A 型逆流色譜儀和AKTAprime plus 層析系統(tǒng)共同組成的高速逆流色譜聯(lián)用系統(tǒng), 對藤茶提取物中的二氫楊梅素進行純化, 選用溶劑系統(tǒng)為石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶水∶三氯乙酸( 體積比1 .00∶3 .00∶2 .00∶2 .00∶0 .05) , 可將粗提物中的二氫楊梅素提純到99 .00 % 以上,5 h 內(nèi)可純化50 g粗樣品, 分離得率為85 .50%[ 34] 。

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