杜仲乙醇提取物對(duì)大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)的作用及機(jī)制 | 杜仲乙醇提取物對(duì)大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)的作用及機(jī)制 |
| 發(fā)布時(shí)間:2010-08-23 信息來(lái)源:admin 發(fā)布人:admin 點(diǎn)擊次數(shù):3730 |
岳曉潔 1，，張炯炯1 ，許逸飛 1 ，葉志孟 1 ，張 薇 1，王會(huì)平2 （1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床二系，浙江杭州 310031; 2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，浙江 杭州 310031） [摘要]：目的：探討杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）醇提物對(duì)離體大鼠主動(dòng)脈環(huán)收縮張力的作用及其可能機(jī)制。方法：采用大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)灌流模型，采用累積加藥法，觀察杜仲醇提物對(duì)PE 預(yù)收縮（苯腎上腺素組+E,-E）、氯化鉀預(yù)收縮（氯化鉀組+E,-E）的血管環(huán)的作用; 并檢測(cè)杜仲對(duì)經(jīng)無(wú)鈣液預(yù)處理后的血管環(huán)的作用。結(jié)果：不論是否有內(nèi)皮，累計(jì)濃度杜仲對(duì)高濃度KCL 及PE 引起的血管環(huán)收縮均有明顯的舒張作用。格列苯脲（Glib），4－氨基吡啶(4－AP),四乙胺（TEA）,L-NAME,ODQ，吲哚（Indo）不能阻斷杜仲對(duì)PE 預(yù)收縮血管環(huán)的舒張。胸主動(dòng)脈環(huán)經(jīng)無(wú)鈣液孵育和杜仲處理后對(duì)PE 的反應(yīng)性降低。結(jié)論：杜仲對(duì)胸主動(dòng)脈環(huán)有非內(nèi)皮依賴(lài)性的舒張作用，杜仲能通過(guò)抑制內(nèi)鈣釋放而起到舒張血管環(huán)的作用。 [關(guān)鍵詞]：杜仲乙醇提取物；胸主動(dòng)脈環(huán)；內(nèi)皮；鈣通道 Relaxant effect of Eucommia ulmoides Oliv On rat thoracic aorta YUE Xiao-jie, ZHANG Jiong-jiong, XU Yi-fei, YE Zhi-men, ZHANG Wei ,et al (The Second Department of Clinical Medicine, College of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou 310031) [Abstract] Objective: To investigate the effect of Eucommia ulmoides Oliv on vascular circles and the underlying mechanisms. Methods: The study was performed with the model of isolate rat thoracic aorta rings in organ bath.The effect of accumulated of ethanol extract of the eucommia bark(EB) on aorta rings (+E,-E), pre-contracted with PE, and pre-contracted with KCl was observed. The effect of EB on aorta rings(-E) pre-contracted with PE(-E) with Ca2+ -free medium was also observed. Conclusion: With or without endothelium, communicative concentration EB has vasorelaxant effects on the thoracic aorta pre-contracted by KCL or PE. nitric oxide synthase inhibitor L-N (G)-nitroarginine methyl ester ( L-NAME), the Soluble guanylyl cyclase Inhibitor ODQ, voltage-dependent K+ channel inhibitor 4-AP,calcium-activated K+ channel inhibitor TEA, ATP-sensitive K+ channel inhibitor Glib, and cyclooxygenase inhibitor indomethacin can’t inhibit EB’s vasorelaxant effects. EB has no relaxation effect on aorta rings which are incubated with Ca2+ -free Kreb’s solution and pre-contracted with PE. Conclusion: EB can relax the rat thoracic aorta rings endothelium independent. And one mechanism is by inhibiting of intracellular calcium ions release . [Key words] :ethanol extract of the eucommia bark；The ring of thoracic aorta；endothelium；Ca2+ channel 杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）是杜仲科植物，我國(guó)特有經(jīng)濟(jì)樹(shù)種。杜仲皮是傳統(tǒng)中藥，具有補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，安胎，益壽和降血壓的作用。甚至在抗HIV方面,心血管方面，免疫系統(tǒng)，抗衰老，骨細(xì)胞增殖，抗腫瘤作用都有發(fā)現(xiàn)，在臨床上已應(yīng)用復(fù)方杜仲降壓片治療高血壓病[1-2]。然而關(guān)于杜仲對(duì)離體血管作用的研究尚處在初始階段，并沒(méi)有大家公認(rèn)的確切作用及機(jī)制的報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)在大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)灌流模型的基礎(chǔ)上，研究杜仲醇提掖對(duì)血管張力的影響并探討其可能的作用機(jī)制。 1．材料和方法 1.1 設(shè)備： 離體血管環(huán)灌流裝置：HSS-1B數(shù)字式超級(jí)恒溫浴槽，J2J01型張力換能器； RM6240BD型多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)，均由成都儀器廠提供。 1.2 藥物與試劑： 苯腎上腺素（Phenylephrine, PE）、乙酰膽堿（Acetylcholine, ACh）、L-NAME（L-N (G)-nitroarginine methyl ester）、吲哚美辛（Indomethacin，Indo）、4-氨基吡啶（4-aminopyridine,4-AP）、四乙胺（Tetraethylammonium, TEA）、格列苯脲（Glibenclamide）、 ODQ（1H-(1,2,4)oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one）、 EGTA（ethylene glycol-bis [ β-aminoethylether ]-N , N , N ’N ’-tetraacetic acid)、DMSO（dimethyl sulfoxide）、4% DMSO、均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。初濃度為20mg/ml的杜仲醇提液。Krebs-Henseleit (K-H)液(mmol/L):NaCl 118，KCl 4.7，KH2PO 4 1.2，MgSO4 1.2，NaHCO3 25，CaCl2 1.25，glucose 10，無(wú)鈣Krebs-Henseleit液(mmol/L)：NaCl 118，KCl 4.7，KH2PO 4 1.2，MgSO4 1.2，NaHCO3 25，glucose 10，EGTA 0.05。 1.3 血管環(huán)的制備： Sprague-Dawley (SD) 大鼠, 雄性, 體重220-270g, 由浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。每只大鼠的胸主動(dòng)脈被分成6段,并隨機(jī)分入不同的6個(gè)實(shí)驗(yàn)組中進(jìn)行平行研究,以保證不同組內(nèi)的血管環(huán)均來(lái)自不同的大鼠。用鈍器擊昏大鼠后，充分放血, 迅速取胸主動(dòng)脈, 置于通以95% O2+5% CO2 混合氣體的K-H液中, 去除周?chē)Y(jié)締組織后將血管剪成約3～4 mm 寬的血管環(huán),避免過(guò)度牽拉, 以防損傷內(nèi)皮。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要, 去除血管內(nèi)皮時(shí), 用棉簽?zāi)ゲ裂墉h(huán)內(nèi)表面以去除內(nèi)皮細(xì)胞。將血管環(huán)放入含K-H液的浴槽內(nèi), 持續(xù)通以95% O2+5% CO2的混合氣體, 將靜息張力調(diào)至2.0 g 在37 ℃下穩(wěn)定1 h , 期間每15 min 換液一次。用6×10-2mol/L的KCl重復(fù)刺激3 次, 以誘發(fā)血管的最大收縮幅度。待血管環(huán)穩(wěn)定后, 用10-6mol/L PE 收縮血管環(huán)達(dá)峰值, 加入10-6mol/L ACh 檢驗(yàn)血管內(nèi)皮完整性。舒張60-90%為內(nèi)皮完整，20%以下為去內(nèi)皮。實(shí)驗(yàn)用RM6240BD型多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)記錄血管張力變化，分別以末次PE(1μmol/L)、KCl（6×10-2mol/L）誘發(fā)最大收縮幅度為100%,以加入藥物后的血管張力幅度與PE或KCl誘發(fā)最大收縮幅度之間的比率反映血管張力的變化。 1.4 實(shí)驗(yàn)分組： 1.4.1 累積濃度杜仲對(duì)PE預(yù)收縮的血管環(huán)的作用: 實(shí)驗(yàn)組(n= 9)以PE ( 1 μmol/ L )預(yù)收縮內(nèi)皮完整血管環(huán)，用累積加藥法,每10min 加杜仲1 次, 使灌流液中杜仲終濃度分別達(dá)0.2、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2 (mg/ml),觀察杜仲對(duì)內(nèi)皮完整血管環(huán)的作用; 對(duì)照組(n= 4)以K-H 液代替杜仲累積加入。為了考慮內(nèi)皮的作用，再加上一組去內(nèi)皮組(n=12)，觀察杜仲對(duì)去內(nèi)皮血管環(huán)的作用。 1.4.2 累積濃度杜仲對(duì)KCl預(yù)收縮的血管環(huán)的作用:用KCl（6×10-2mol/L）代替PE ( 1 μmol/ L )預(yù)收縮內(nèi)皮完整血管環(huán)，具體方法同1.4.1，其中內(nèi)皮完整組n=6,去內(nèi)皮組n=2。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中沒(méi)有做K-H液代替杜仲累積加入的對(duì)照組。 1.4.3 杜仲對(duì)無(wú)鈣液預(yù)處理的血管環(huán)的作用(無(wú)鈣液組):實(shí)驗(yàn)組(n= 4) 以無(wú)鈣液預(yù)處理內(nèi)皮去除的血管環(huán), 用3.2mg/ml 杜仲共浴15min 后, 再加入PE ( 1 μmol/ L )使血管收縮,觀察杜仲的作用。對(duì)照組(n= 4) 以K-H 液代替杜仲孵浴去內(nèi)皮血管環(huán)。1.4.4 Indo、L-NAME、ODQ 對(duì)杜仲作用影響組(n =6):分別用0.01mmol/L Indo、L-NAME、ODQ預(yù)處理內(nèi)皮完整的主動(dòng)脈環(huán)20 min,用PE ( 1 μmol/ L ) 預(yù)收縮血管達(dá)穩(wěn)態(tài)后, 采用累積加藥法，同1.4.1加藥方法。觀察杜仲對(duì)內(nèi)皮完整血管環(huán)的作用。以1.4.1中杜仲對(duì)PE預(yù)收縮內(nèi)皮完整血管環(huán)的作用為對(duì)照。 1.4.5 4-AP,TEA,Glib對(duì)杜仲作用影響組。實(shí)驗(yàn)組(n=6)分別用1mmol/L 4-AP；1mmol/L TEA;3μmol/L Glib代替0.01mmol/L Indo，其中4-AP,TEA累計(jì)加藥濃度為0.2、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 (mg/ml)。其余同1.4.4。 1.5 統(tǒng)計(jì)處理： 實(shí)驗(yàn)結(jié)果以⎯x±s表示，用excel做統(tǒng)計(jì)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為有顯著性差異。 2. 結(jié)果 2.1 累積濃度杜仲對(duì)PE預(yù)收縮的血管環(huán)的作用： 杜仲（0.2，0.4，0.8，1.6，3.2mg/ml）可使PE預(yù)收縮的內(nèi)皮完整胸主動(dòng)脈環(huán)舒張，比PE預(yù)收縮時(shí)的張力明顯降低（P<0.05）,而對(duì)照組，累積加入K-H液對(duì)內(nèi)皮完整胸主動(dòng)脈環(huán)舒張作用不明顯，累計(jì)濃度杜仲亦可使去內(nèi)皮的胸主動(dòng)脈環(huán)舒張（P<0.05）（圖一）。 2.2 杜仲對(duì)高鉀預(yù)處理之后收縮的血管的作用 為觀察杜仲是否對(duì)KCL誘導(dǎo)的血管收縮作用有影響，用KCL（6×10-2mol/L）預(yù)收縮血管，結(jié)果表明，杜仲對(duì)KCL（6×10-2mol/L）預(yù)收縮的內(nèi)皮完整或去內(nèi)皮動(dòng)脈環(huán)都有明顯的舒張作用，且兩者無(wú)顯著性差異（P>0.05） (圖二) 2.3 杜仲對(duì)無(wú)鈣液預(yù)處理的血管環(huán)的作用 用無(wú)鈣液預(yù)處理去內(nèi)皮血管環(huán)，去除細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流的影響后，與對(duì)照組比較，3.2mg/ml的杜仲對(duì)PE引起的血管環(huán)收縮作用有明顯抑制 (P<0．01)（圖三）。
2.4 Indo，L-NAME，ODQ對(duì)杜仲作用影響 環(huán)氧合酶抑制劑Indo(10μmol／L)預(yù)處理后，杜仲使PE預(yù)收縮的內(nèi)皮完整血管產(chǎn)生的舒張作用未被減弱。與正常對(duì)照組血管相比，舒張作用反而加強(qiáng)，但無(wú)顯著性差異（P<0.05）。一氧化氮合酶抑制劑L-NAME與鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶抑制劑ODQ不能阻斷累積濃度杜仲對(duì)PE預(yù)收縮的內(nèi)皮完整的胸主動(dòng)脈環(huán)的舒張作用，且都無(wú)顯著性差異（P>0.05）（圖四） 2.5 Gli、4-AP、TEA對(duì)杜仲作用的影響 KATP抑制劑Gli(3μmol／L)預(yù)處理后，杜仲對(duì)PE預(yù)收縮的血管環(huán)的舒張作用未減弱，與對(duì)照組相比，舒張作用無(wú)明顯變化(P>0.05)。電壓門(mén)控的K通道抑制劑4-AP(1mmol／L), 鈣敏感鉀通道阻斷劑TEA(1mmol／L)預(yù)處理后，杜仲使PE預(yù)收縮的內(nèi)皮完整血管產(chǎn)生的舒張作用,與正常對(duì)照組血管相比，反而加強(qiáng)，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)。（圖五）
3.討論： 日本學(xué)者Chiu-Yin Kwan等人之前已做過(guò)相關(guān)研究，表明杜仲葉和皮的水提物具有內(nèi)皮依賴(lài)性的舒張作用，NO途徑及內(nèi)皮上的K通道的活化可能參與其舒張作用，而不涉及血管內(nèi)皮的M膽堿受體，且杜仲葉的甲醇提取物無(wú)血管舒張作用[3]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，杜皮 的乙醇提取物使PE和KCL預(yù)收縮的大鼠動(dòng)脈環(huán)舒張，且呈濃度依賴(lài)性。 研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)釋放的血管舒張物質(zhì)在調(diào)節(jié)血管平滑肌的張力中起重要的作用[4.5]。從內(nèi)皮細(xì)胞中釋放的最重要的一種物質(zhì)是內(nèi)皮依賴(lài)性舒張因子(EDRF)，現(xiàn)在被確認(rèn)為是NO[4.6]，NO在維持血管靜息張力中起重要作用，作為一種內(nèi)皮源性舒張因子，其舒血管機(jī)制現(xiàn)已闡明。NO在內(nèi)皮細(xì)胞中合成后，通過(guò)激活可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶(sGC)，引起環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷(cGMP)升高，從而產(chǎn)生舒血管作用[7]。后者主要通過(guò)cGMP依賴(lài)性蛋白激酶使 鈣內(nèi)流減少，增加鈣ATP酶對(duì)鈣的攝取或直接作用于收縮蛋白去磷酸化而使血管舒張。細(xì)胞因子通過(guò)激活NO合酶而促進(jìn)NO合成，可產(chǎn)生多種生物效應(yīng)，包括改變血管的反應(yīng)性和降低血壓等。為了研究杜仲的血管舒張作用是否是內(nèi)皮依賴(lài)性的，我們用NO合酶抑制劑L-NAME和鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶抑制劑ODQ處理血管，發(fā)現(xiàn)杜仲的舒張血管作用未被阻斷，提示NO途徑可能未參加杜仲的舒張血管作用。
由花生四烯酸在環(huán)氧合酶催化下產(chǎn)生的PGI2也是重要的內(nèi)皮依賴(lài)性舒張因子，為了驗(yàn)證該途徑是否參與杜仲的舒血管作用，我們用環(huán)氧合酶抑制劑吲哚美辛處理血管，發(fā)現(xiàn)杜仲的舒張血管作用亦未被阻斷，提示PGI2亦未參加杜仲的舒血管作用。血管平滑肌的舒張與鉀離子通道有關(guān)，本試驗(yàn)欲研究鉀通道是否參與杜仲的舒血管作用及具體為哪一通道，故分別采用ATP依賴(lài)性鉀通道抑制劑格列苯脲（Glib），電壓門(mén)控鉀通道抑制劑4－氨基吡啶(4－AP),配體門(mén)控鉀通道抑制劑四乙胺（TEA）處理血管，均未引起杜仲舒血管作用的變化，說(shuō)明各種鉀通道未參與杜仲的舒血管作用。 既往研究認(rèn)為，血管平滑肌的收縮主要是依賴(lài)細(xì)胞外鈣離子的內(nèi)流(包括受體操作性鈣通道，電壓依賴(lài)性鈣通道以及鈣釋放激活的鈣通道)和細(xì)胞內(nèi)鈣離子的釋放(通過(guò)肌醇1，4，5一三磷酸受體及rya-nodine受體途徑)而使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的增加。KCl通過(guò)平滑肌細(xì)胞超極化而刺激血管收縮，其機(jī)制主要是使電壓依賴(lài)性鈣通道開(kāi)放,為此我們推測(cè)杜仲可能通過(guò)抑制外鈣內(nèi)流而具有血管舒張作用，為了確定杜仲是否因阻斷外鈣內(nèi)流引起的內(nèi)鈣釋放而舒張血管，尚需阻斷內(nèi)鈣進(jìn)一步研究。PE誘導(dǎo)的血管收縮是由a-腎上腺素受體的激活造成的， 主要是通過(guò)激活磷脂酶C，產(chǎn)生甘油二酯(diacylglycerol，DG)和三磷酸肌醇(1，4，5-triphos-phate inositol，IP3)，DG 可以通過(guò)蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)激活肌凝蛋白輕鏈，而IP3則可以誘導(dǎo)肌漿網(wǎng)內(nèi)的鈣離子釋放[8.9]，這是否提示杜仲舒張血管作用的機(jī)制，可能是通過(guò)影響內(nèi)貯鈣的釋放產(chǎn)生舒張作用。為了進(jìn)一步證明，我們又用無(wú)鈣液預(yù)處理去內(nèi)皮血管環(huán)，發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈環(huán)經(jīng)無(wú)鈣液孵育及杜仲處理后，血管對(duì)PE的反應(yīng)性明顯降低，表明杜仲可能通過(guò)阻斷內(nèi)鈣釋放起血管舒張作用。 綜上所述，杜仲乙醇提取物的舒血管作用是非內(nèi)皮依賴(lài)性的，其可能的機(jī)制是抑制內(nèi)鈣釋放。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各種抑制劑處理后，杜仲的血管舒張作用未減弱，有些甚至加強(qiáng)，可能與杜仲種植方法，提取工藝，及實(shí)驗(yàn)操作有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步研究。 4.參考文獻(xiàn)： [1] Hua Hui-ming , Yin Hong-quan ,Li Bao-qiang ,Pei Yue-hu (華會(huì)明 尹宏權(quán) 李寶強(qiáng) 裴月湖).Study on the Constituents of the Bark of Eucommia ulmoides [J]. Molecular Plant Breeding (分子植物育種),2003,1(5/6):801-803 (in Chinese) [2] Li Zu, Yan Yuan, Li Qing(李竹 晏媛 李青).The progress in research of Eucommia ulmoides and its pharmacology [J]. Chinese Pharmaceutical Affairs (中國(guó)藥事)，2004，18（2）：131-132 (in Chinese) [3]. Chiu-Yin Kwan,Chang-Xun Chen,Takeshi Deyama,Sansei Nishibe.Endothelium-dependent vasorelaxant effects of the aqueous extracts of the Eucommia ulmoides Oliv.Leaf and baek：implications On their antihypertensive action.Vascular pharmacology;40(2004)229-235. [4]. Moncada S，Palmer RM，Higgs EA．Nitric oxide：physiology，pathophysiology，an dpharmacology．Pharmacol Rev 1991；43：1o9—142． [5]. Furchgott RF，Vanhoutte PM．Endothelium—derived rela．xing and contracting factors． FASEB J 1989：3：2007 ～2O18． [6] Palmer RM，F(xiàn)errige AG，Moncada S．Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium．Derived relaxing factor．Nature 1987；327(6122)：524～526． [7] Rapoport RM，Murad F．Agonist·induced endothelium—de．pendent relaxation in rat thoracicaorta may be mediated through cGMP．Circ Res 1983；52：352～357． [8]GAO Yu—qi．SUN Bing—yong(高鈺琪，孫秉庸)．Cacium dynamics of vascular smooth muscle cell[J]．Progress in Physiological Sciences(生理科學(xué)進(jìn)晨)，1990，21(4)：305— 309．(in Chinese) [9].wU Qi—xia．YU Ying—nian．LU Jian(吳其夏．余應(yīng)年．盧 建)．New Pathophysiology (新編病理生理學(xué)) [M]．Beijing：Peking Union Medical College Press，1999．136— 142．(in Chinese) [8] 楊世杰.藥理學(xué)，人民衛(wèi)生版社， 2001.8第一版。 [9]宋今丹.醫(yī)學(xué)細(xì)胞分子生物學(xué)，人民衛(wèi)生版社，2003.1第一版。 [10]陸源，夏強(qiáng).生理科學(xué)實(shí)驗(yàn)教程，浙江大學(xué)出版社，2004.8第一版。
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