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王瓊1，陳建軍2，向謹逸3

(1湖北省新華醫(yī)院，湖北武漢430015；2崇陽縣人民醫(yī)院；3華中科技大學同濟醫(yī)學院)

[摘要] 目的觀察熊果酸(UA)對胃癌細胞林MGC一803的抑制增殖作用。方法培養(yǎng)胃癌細胞株MGC一803，以MTT比色法及生長曲線測定UA對MGc一803抑制增殖的作用。免疫印記法測定p-ERK．加Cyelin D1、p21訓“”1表達。結果MTT實驗及生長曲線均顯示uA明顯抑制MGC一803細胞增殖，免疫印記法顯示uA抑制PERK。小Cyel nUI表達，同時上調(diào)p21刪⋯表達。結論熊果酸可以抑制MGC一803增殖，機制與影響p-ERK。，：及下

游Cyclin D1、p21⋯91表達有關。

[關鍵詞]熊果酸；胃腫瘤；細胞外信號調(diào)節(jié)激酶；增殖

熊果酸(UA)又名烏索酸、烏蘇酸，屬于三萜類化臺物，廣泛存在于熊果、白花蛇舌草、女貞子、烏梅等天然植物和草藥中，具有抗炎、護肝、降血脂等多種生物學活性，近年來其抗腫瘤作用日益受到重視。研究發(fā)現(xiàn)uA可抑制多種腫瘤細胞增殖并誘導其凋亡”。J，但作用機制尚不十分清楚。2006年9月一2007年3月，我們使用不同濃度熊果酸作用于胃癌MGC_803細胞株，檢測細胞增殖的各項指標，研究P—ERK。、Cyclin D1及p21“J。�！暗谋磉_情況，旨在為其用于抗腫瘤治療方面奠定試驗基礎。

1材料與方法

I．1材料胃癌細胞株MGC一803由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗中心提供。熊果酸購自武漢天源生物技術公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國Sigma公司；標準蛋白及增強化學發(fā)光劑ECL購于New England Biolab公司，小鼠抗大鼠p-ERKI／2、Cyclin DI及p21””1單克隆抗體抗體、堿性磷酸酶標記山羊抗小鼠第二抗體、堿性磷酸酶顯色試劑盒

購于北京中山生物公司。

1．2實驗方法

1 2．1細胞培養(yǎng)MGC．803細胞在含10％胎牛血清及青、鏈霉素各l×105 U／L的BPMI 1640培養(yǎng)基中貼壁生長，于37 oC、5％CO2：培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，取3～6代細胞用于實驗。按照培養(yǎng)基中試劑不同，將培養(yǎng)的MGC-803細胞隨機分為4組：對照組(培養(yǎng)基)；10、20、40 p．．mol／L UA組。收集對數(shù)生長期的細胞，以5 X105個細胞／ml接種二I_．培養(yǎng)瓶，24 h換液1次。當細胞達到亞融合狀態(tài)，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h。按分組要求加入不同濃度熊果酸、培養(yǎng)基，使各瓶終體積均為2 m1。12 h后收集細胞，進行F列測定。

1．2．2 M‘rr比色消化處于對數(shù)生長期的細胞以5 X t05個細胞／ml接種于96孔板，在37℃、5％CO2，、飽和濕度條件下培養(yǎng)。當細胞達到亞融合狀態(tài)時，每iL加入200“l(fā)無血清培養(yǎng)基，12 h后棄培養(yǎng)基。加入不同量的熊果酸及培養(yǎng)基，各孔終體積均為200山。2 d后棄培養(yǎng)基，每孔加MTF溶液(5 mg／m1)20“l(fā)。孵育4 h，每孔加入150“DMSO，振蕩10 rain，用酶聯(lián)免疫檢測儀讀取每7L OD值(測量波艮620 11111，參考波長490 nRl)。生長抑制率IR(％)=1一B／A X100％(A、B分別為對照組和實驗組的光密度值)。

1．2．3生長曲線測定取對數(shù)生長期細胞2×104置丁25 m1培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h后，去培養(yǎng)液，加入以上分組的培養(yǎng)液和熊果酸，連續(xù)培養(yǎng)6 d，每天取6瓶細胞，以臺盼藍法計算活細胞數(shù)，繪制生長曲線。

1．2，4免疫印跡法(Westem blot)檢測p-ERK。／2、Cyclin DI、p21““”“蛋白表達取5×105個各組干預后的細胞，加入5倍體積的細胞裂解液孵育20min。取40斗g總蛋白加人卜樣緩沖液煮沸變性，經(jīng)SDS／PAGE凝膠電泳，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉后與1：1 000稀釋的一抗4℃孵育過夜，再與1：10 000稀釋的二抗室溫孵育2 h，與增強化學發(fā)光試劑溫浴5 rain后曝光、顯影和定影，對結果進行吸光度掃描分析．并與對照組結果進行對比。

1．3統(tǒng)計學方法所有數(shù)據(jù)均采用i±s表示，采用SPSS 10．0軟件包進行方差分析，以尸≤0．05為有統(tǒng)計學差異。

2結果

2．1 熊果酸對MGC一803細胞增殖的抑制作用MTT比色法檢測結果顯示，對照組及10、20,40 I．mM／L UA組IR分別為0、12．16％±3．26％、34．36％±6．26％、53．80％±9．22％，后三組均明顯高于對照組(P<0．05、<0．01、<0．0l、n=8)，且隨著濃度升高，IR明顯上升。

2．2熊果酸對MGC一803細胞生長曲線的影響見圖1。

2．3熊果酸對p-ERKm、Cyclin DI、p21”“叫表達影響見表1。

3討論

細胞外調(diào)節(jié)信號激酶(ERK)是MAPK家族的一個亞族，家族中研究最多，也最重要的是ERK。。町被多種生長因子、細胞因子激活，參與調(diào)節(jié)細胞的增殖與分化。ERK活化后通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)引起多種基因包括細胞周期素Dl(Cyclin D1)等基因的相繼激活導致細胞惡性轉(zhuǎn)化，在細胞生長、發(fā)育、分裂、死亡及惡性轉(zhuǎn)化等過程中起重要作用．4J。Cyclin D1屬細胞周期抑制因子，是G．／S期轉(zhuǎn)化的重要蛋白，研究發(fā)現(xiàn)其在腫瘤細胞巾表達增高，并與腫瘤細胞異常增殖、侵襲和預后有關。p21””⋯⋯是最早發(fā)現(xiàn)和克隆的家族成員之，其羧基端與PCNA結合，使之不能與DNA聚合酶形成復合物，影響DNA復制，阻止細胞周期進程；其氨基端與Cyclin D／E結合，從而使RB蛋白不能磷酸化，使細胞周期停滯于G．期。有研究表明p21““”蛋白與細胞衰老、分化及腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關。

本研究結果顯示，熊果酸濃度依賴性抑制MGC一803細胞增殖率。卒文結果亦提示，熊果酸抑制MGC-803細胞生長的作用町能與影響ERK信號通路及其下游信號分子如Cyclin D1、p2i“““有關。但尚不能排除熊果酸對其他促瘸細胞生長的信號通路的干預。

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