超聲波輔助法提取山茱萸發(fā)酵產(chǎn)物中的熊果酸 | 超聲波輔助法提取山茱萸發(fā)酵產(chǎn)物中的熊果酸 |
| 發(fā)布時間:2010-09-04 信息來源:admin 發(fā)布人:admin 點擊次數(shù):4925 |
胥佰濤１ , 何國慶１ , 李心泓２ , 于海寧３ , 沈生榮１ (１ . 浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院食品科學(xué)與營養(yǎng)系, 浙江杭州３１００２９ ; ２ . 杭州市藥品檢驗所,浙江杭州３１００１７ ;３ . 浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院,浙江杭州３１００３２ ) 摘 要:采用超聲波輔助法提取山茱萸發(fā)酵產(chǎn)物中的熊果酸,以HPLC 法測定熊果酸含量,并研究熊果酸提取的最佳工藝條件.在３０ ℃ 下,酵母接種量和原料質(zhì)量比為３ ∶ ８０ ,搖床轉(zhuǎn)速為１５０ r·min－ １ 時發(fā)酵效果好,發(fā)酵時間短;在酒精濃度８５％ ,溫度５０ ℃ ,超聲功率１００ W ,時間３０ min 的條件下提取效果最好,熊果酸得率為０.２５１２％ . 關(guān) 鍵 詞: 山茱萸; 熊果酸; 發(fā)酵; 提取 山茱萸( Cornus o f f icinalis Sieb . etZucc) 屬山茱萸系山茱萸科植物,是一種重要的野生資源.其果肉味酸、澀,微溫,歸肝腎經(jīng),有補益肝腎、澀精固脫的功效, 是中醫(yī)臨床常用的傳統(tǒng)抗衰老藥物之一, 主要功能成分為環(huán)烯醚萜類、皂苷、多糖、熊果酸、齊墩果酸、鞣質(zhì)等[ ２] . 熊果酸( ursolie acid ,UA) ,是一種弱極性的五環(huán)三萜酸,其分子式為C３０ H４８ O３ (圖１)[３ ] ,分子量為４５６.６８ ,溶點２８５ ～ ２８７ ℃ ,易溶于二氧六環(huán)、吡啶,可溶于甲醇、乙醇、丁醇,略溶于丙酮,微溶于苯、氯仿、乙醚,不溶于水和石油醚.研究表明,熊果酸具有較高的生物學(xué)活性,包括抗癌、對肝損傷的保護(hù)、抗菌消炎和抗病毒等作用[４ ] .熊果酸具有較高的醫(yī)用價值和保健功能,有廣闊的市場前景,所以熊果酸的提取越來越受到廣大科研學(xué)者的關(guān)注.
山茱萸中熊果酸的提取方法有多種,如索氏提取法、超聲波提取法、乙醇回流提取法、超臨界流體萃取法( SFE) 等.其中超聲波提取法是利用超聲波強大的空化作用使細(xì)胞壁破碎,強化傳質(zhì),能顯著提高熊果酸的提取效率.在原料中加入酵母菌,利用其酵解糖分的特點[５ ] ,分解山茱萸中的糖類,充分消除影響提取過程及效率的雜質(zhì).由于熊果酸屬于萜類,不會因酵母發(fā)酵而影響得率和性質(zhì).降低山茱萸中的糖分,不但可以簡化提取工藝,而且還可以提高粗提物中熊果酸的含量.迄今為止,有關(guān)酵母除糖結(jié)合超聲波輔助提取技術(shù)應(yīng)用于山茱萸中熊果酸提取尚未有文獻(xiàn)報道. １ 材料與方法 1.1 材 料 山茱萸干燥果實產(chǎn)于浙江省臨安市,由杭州天目生物科技有限公司提供.釀酒酵母( Saccharomyces cerev isiae ) , 由安琪酵母股份有限公司生產(chǎn);熊果酸對照品購于中國藥品生物制品鑒定所;甲醇為國產(chǎn)色譜純,其余均為國產(chǎn)分析純. 1.2 儀 器 KYC１００B 型搖床(上海�，攲嶒炘O(shè)備有限公司) ;WYT 型糖量計(福建省泉州市萬達(dá)實驗儀器設(shè)備有限公司) ;KQ２２００DB 型數(shù)控超聲發(fā)生器(江蘇省蘇州市昆山市(縣)超聲儀器有限公司) ;島津LC‐２０A 型高效液相色譜儀(日本島津公司) ;DZX‐６０９０ 真空干燥箱(上海�，攲嶒炘O(shè)備有限公司) . 1.3 方 法 1.3.1 山茱萸提取工藝流程 山茱萸漿(山茱萸干粉＋ 水) 發(fā)酵除糖加酒精超聲提取過濾(棄去濾渣) 濃縮減壓干燥初制品. 1.3.2 材料預(yù)處理 1.3.2.1 山茱萸發(fā)酵. 稱�。玻� g 粉碎過的山茱萸干燥果實,置于三角瓶中,加入４０ mL 水,攪勻,沸水浴加熱. 干酵母活化:按設(shè)定條件,稱取一定量干酵母,加入１０ 倍質(zhì)量的水,４０ ℃ 加熱１５ min ,轉(zhuǎn)移至３０ ℃ 的水浴鍋中,待酵母液體冷卻,轉(zhuǎn)入三角瓶中,用牛皮紙封閉瓶口,置于搖床上,在設(shè)定條件下發(fā)酵. 1.3.2.2 發(fā)酵液糖分含量測定. 每隔１２ h 用糖量計測量發(fā)酵液的糖度,記錄發(fā)酵液糖度的變化. 1.3.2.3 發(fā)酵條件的選擇. 本實驗對發(fā)酵溫度、酵母接種量、搖床轉(zhuǎn)速進(jìn)行單因素探索,分別考察３ 個因素對原材料最終糖度和發(fā)酵速度的影響. 1.3.3 山茱萸中熊果酸提取方法 發(fā)酵完畢后,發(fā)酵液加入８００ mL 不同濃度的酒精,置于超聲發(fā)生器中,控制提取溫度、超聲波功率和提取時間,提取液過濾后定容于１０００ mL 的容量瓶中. 1.3.4 提取液中熊果酸含量測定 1.3.4.1 色譜柱條件. 色譜柱Hypersil C１８ (２５cm × ４.６ mm ,粒徑５ μm) ;流動相:甲醇‐水‐磷酸( ９０ ∶ １０ ∶ ０.１ ) ;檢測波長２１５ nm ,流速１.２mL·min－ １ ;柱溫:室溫.熊果酸對照品和山茱萸的HPLC 圖譜見圖２ ,添加回收率為９４.２％ .
1.3.4.2 對照品溶液制備. 精密稱取干燥至恒重的熊果酸對照品２ mg ,用色譜純甲醇溶解,溶液中熊果酸最終濃度為１ mg·mL －１ ,以微孔膜過濾,置于冰箱內(nèi)冷藏保存,待用. 1.3.4.3 樣品液制備.�。� mL 定容后的提取液,用色譜純甲醇稀釋至１０ mL ,以微孔膜過濾,作為供試品溶液. 1.3.5 正交試驗方案設(shè)計 在預(yù)備實驗的基礎(chǔ)上選取對熊果酸浸提率影響較大的４個因素進(jìn)行正交試驗:酒精濃度,超聲波提取溫度,超聲波功率,超聲波提取時間. 1.4 熊果酸得率計算 X ＝ ( A樣× C標(biāo)× V ) ÷ ( A標(biāo)× M原材料) × １００％ ,式中A樣為初制品峰面積;A標(biāo)為對照品峰面積;C標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品濃度;V 為初制品溶解后溶液體積;M原材料為山茱萸干粉質(zhì)量;X 為熊果酸得率/ ％ . 1.5 數(shù)據(jù)處理 本實驗數(shù)據(jù)用Origin pro ７.５ 版處理,實驗重復(fù)３ 次. ２ 結(jié)果與討論 2.1 發(fā)酵對山茱萸漿糖度的影響 接種酵母于山茱萸漿中,在酵母最適生長條件下進(jìn)行發(fā)酵.發(fā)酵前山茱萸漿的糖度為２０％ .由圖３ 可知,對照組糖度隨發(fā)酵時間變化不顯著,而接種組的山茱萸漿糖度從第２ d 開始變化顯著,到第３ d 變化極顯著,第４ d 到第６ d 其變化維持在較高水平,隨后變化顯著性明顯減弱,第８ 、９ 兩天相比糖度變化無顯著性,維持在８％ .可見通過發(fā)酵能明顯降低山茱萸漿的糖度. 2.2 發(fā)酵條件的選擇 發(fā)酵條件的選擇主要通過考察溫度、接種量和搖床轉(zhuǎn)速３個因素對發(fā)酵速度(用１/ T 表示,T 代表發(fā)酵天數(shù))和發(fā)酵液最終糖度２ 個指標(biāo)的影響來實現(xiàn).試驗結(jié)果表明,不同發(fā)酵處理最終糖度均介于７％ ～８％ 之間,變化不明顯. 2.2.1 發(fā)酵溫度的選擇 控制搖床轉(zhuǎn)速１５０ r·min－１ ,接種量３ ∶ ８０ ,比較搖床溫度在２０ 、２５ 、３０ 和３５ ℃ 下的發(fā)酵速度. 溫度是影響發(fā)酵的主要因素之一,根據(jù)發(fā)酵第一定律[６ ] ,在某一溫度范圍內(nèi),發(fā)酵速度
和溫度成正比,每增加１０ ℃ ,發(fā)酵速度將增加１倍.當(dāng)溫度超過酵母生長最適宜溫度時,高溫對酵母的生長會產(chǎn)生抑制作用.由圖４ 可知,發(fā)酵速度隨著搖床溫度上升逐漸提高,到３０ ℃ 時達(dá)到最高,溫度再繼續(xù)升高到３５ ℃ 時,發(fā)酵速率有所降低.可見當(dāng)搖床溫度設(shè)為３０ ℃ 時發(fā)酵溫度接近酵母生長最適溫度,發(fā)酵速率最快.
2.2.2 接種量的選擇 控制發(fā)酵溫度３０℃ ,搖床轉(zhuǎn)速１５０ r·min－ １ ,考察酵母接種量對發(fā)酵時間的影響. 接種量是影響酵母發(fā)酵速度的因素之一.酵母生長有４ 個時期,即遲滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰老期,其中遲滯期糖分分解速率比較低,穩(wěn)定期最高.而接種量的多少直接影響到酵母生長遲滯期的長短,接種量越多遲滯期越短,進(jìn)入穩(wěn)定期所用時間越短,達(dá)到糖分最大分解速率所用時間就越短.由圖５ 可知,發(fā)酵速率隨著接種量的增加而增加,但是增加的趨勢逐漸減小,當(dāng)接種量為３ ∶ ８０ 和４ ∶ ８０ 時,發(fā)酵速率差別已經(jīng)不明顯.綜合考慮時間和成本２ 個因素,選擇生產(chǎn)用量為３ ∶ ８０ . 2.2.3 搖床轉(zhuǎn)速的選擇 控制發(fā)酵溫度３０℃ ,接種量３ ∶ ８０ ,考察搖床轉(zhuǎn)速對發(fā)酵時間的影響. 搖床轉(zhuǎn)速也是影響發(fā)酵的重要因素之一.搖床搖動對發(fā)酵的有利影響主要有２個方面:
其一是通過搖床搖動能夠使發(fā)酵液中氧氣含量升高,有利于酵母代謝,加速糖分降解;其二是通過搖床搖動能夠使酵母充分與發(fā)酵液混合,使發(fā)酵更加充分.但并非轉(zhuǎn)速越高發(fā)酵速率越高,在發(fā)酵液氧氣含量充足和酵母、發(fā)酵液混合充分的條件下,酵母已經(jīng)達(dá)到最適生長狀態(tài),增加轉(zhuǎn)速,發(fā)酵速率將不會提高.由圖６ 可知,發(fā)酵速率隨著搖床轉(zhuǎn)速增加而增加,但是增加的趨勢趨于平緩.當(dāng)轉(zhuǎn)速從１５０ r·min－ １ 增加到１７０ r·min－ １ 時,發(fā)酵速率的增加已不明顯.可見,轉(zhuǎn)速控制在１５０ r·min－ １ 最合適.
2.3 熊果酸提取工藝參數(shù)的確定 2.3.1 正交因素水平表設(shè)計 選擇酒精濃度( A ) 、超聲波提取溫度( B) 、超聲波功率( C)和超聲波提取時間( D)４ 個因素,利用４ 因素３水平正交試驗分析上述４ 種因素對山茱萸中熊果酸提取效果的影響(表１) . 2.3.2 正交試驗結(jié)果 在單因素試驗基礎(chǔ)上,設(shè)計L９ ( ３４ ) 正交試驗,正交試驗結(jié)果見表２ . 由表２ 可知,超聲提取溫度和超聲功率的極差值較大,兩因素對熊果酸的提取影響比較大,而酒精濃度和提取時間極差值相對較小,對熊果酸提取影響不明顯.各因素對熊果酸提取影響的大小次序為:B ( 超聲波提取溫度) ＞ C(超聲功率) ＞ A ( 酒精濃度) ＞ D(超聲波提取 時間) .最佳提取方案為:A２ B３ C３ D３ ,即酒精濃度８５％ ,提取溫度５０ ℃ ,超聲率１００ W ,超聲時間３０ min .追加試驗結(jié)果表明,在此條件下熊果酸的浸出率為０.２５１２％ .
2.4 熊果酸得率及分析 通過HPLC 法測定,計算出在最優(yōu)工藝條件下熊果酸得率為０.２５１２％ .該工藝的熊果酸得率明顯高于其他方法,如索氏提取法提取率１.８２ mg·g － １ [ ７ ] (得率為０.１８２％ ) ,超聲波提取法提取率１.８４ mg·g － １ [ ７ ] (得率為０.１８４％ ) ,乙醇回流提取法提取率２.２ mg·g － １ [８ ] ( 得率為０.２２％ ) .該工藝之所以有高的熊果酸得率,主要有２ 個方面的原因:一是通過發(fā)酵預(yù)處理酵母代謝掉了原料中大量糖分,有助于熊果酸的溶出;二是合適條件下的超聲波處理使植物細(xì)胞最大程度的破碎,使熊果酸能最大程度的和提取劑接觸,降低了熊果酸溶出的阻力. ３ 結(jié) 論 3.1 山茱萸中熊果酸的最佳提取工藝及熊果酸得率:發(fā)酵參數(shù)為發(fā)酵溫度３０ ℃ ,酵母菌接種量和原料比值３ ∶ ８０ ,搖床轉(zhuǎn)速１５０ r ·min－ １ ,時間５ d .超聲波提取參數(shù)為酒精濃度８５％ ,提取溫度５０ ℃ ,超聲功率１００ W ,提取時間３０ min .熊果酸得率為０.２５１２％ . 3.2 酵母發(fā)酵法除糖是利用酵母菌能對糖及其衍生物降解,在合適的工藝參數(shù)下,該方法能顯著降低山茱萸的糖度而不影響熊果酸含量. 3.3 超聲波輔助提取法能夠提高提取率的主要原因是超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)[８ ] ,能有效破碎細(xì)胞壁,增大細(xì)胞的通透性,強化傳質(zhì),從而提高提取效率.超聲波法提取熊果酸,在合適的工藝參數(shù)下提取時間短、提取溫度較低、收率高、快捷、簡便易行. 3.4 超聲波輔助發(fā)酵法提取熊果酸工藝能顯著提高熊果酸得率,降低提取過程中的處理難度,方法簡便易行,為熊果酸提取提出了新思路,也為山茱萸綜合利用奠定了基礎(chǔ). References : [ １ ] DAI Jian‐zi , ZHANG Zhi‐hao , TANG Lei , et al . ( 戴建子, 張志豪, 唐蕾,等) .Progress in research of chemical component and pharmacology of Cornuso f f icinalis [ J] . China Pharmaceuticals ( 中國藥業(yè)) ,２００６ , １５ : ７４‐７５ . (in Chinese) [ ２ ] ZHOU Jing‐hua , LI Chun‐sheng , LI Dian‐dong ( 周京華,李春生,李電東) . Progress in research of the activechemical components of Cornus o f f icinalis [ J] .Chinese Journal of New Drugs ( 中國新藥雜志) , ２００１ ,１０(１１) : ８０８‐８１２ . (in Chinese) [ ３ ] Rajendrasozhan S , Periyaswamy V , Kodukkur V .Protective effect of ursolic acid on ethanol‐mediated experimental liver damage in rats [ J] . Life Sciences ,２００６ , ７８ : ７１３‐７１８ . [ ４ ] XIONG Bin , LEI Zhi‐yong , CHEN Hong ( 熊斌, 雷志勇, 陳虹) . Progress in research of pharmacology of ursolic acid [ J] . Foreign Medical Sciences Section on Pharmacy( 國外醫(yī)學(xué)藥學(xué)分冊) , ２００４ , ３１ ( ３ ) : １３３‐１３６ . (in Chinese) [ ５ ] 陳思妘, 蕭熙佩. 酵母生物化學(xué)[ M] . 濟南: 山東科學(xué)技術(shù)出版社, １９９０ : ３４‐３６ . [ ６ ] WANG Su‐hui , LI Xia ( 王蘇輝, 李霞) . Thetechnological conditions of fermentation and reproduction of wine yeast [ J] . Liquor‐Making Science& Technology ( 釀酒科技) , １９９９ , ９６ ( ６ ) : ２９‐３０ . ( in Chinese) [ ７ ] ZHAO Yu‐chong , LI Jian‐jun , LIU Guo‐ji , et al .( 趙玉叢, 李建軍, 劉國際,等) . Extraction of ursolic acid from Cornus o f f icinalis and content determination[ J] . Journal of Zhengzhou University ( 鄭州大學(xué)學(xué)報) ,２００５ , ３ : ７８‐８１ . (in Chinese) [ ８ ] YANG Zhi‐kun , WANG Shi‐ming ( 楊志坤, 王世明) .Extraction of ursolic acid from Cornus O f f icinalis [ J] .Journal of Heilongjiang Cereals and Oils Science and Technology( 黑龍江糧油科技) , １９９９ ( ４ ) : ５２‐５２ . ( in Chinese) [ ９ ] GUO Xiao‐wu (郭孝武) . A method of extract chemical components from Chinese herbs with ultrasound [ J] .Natural Product Research and Development( 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)) , １９９９ , l ( ３) : ３７‐４０ . (in Chinese) 產(chǎn)品鏈接： 杜仲提取物 綠原酸 金銀花提取物 苦杏仁苷 枇杷葉提取物-熊果酸 大花紫薇提取物-科羅索酸 上禾生物 專注植提 精于高純 基于您對天然產(chǎn)物需求持續(xù)創(chuàng)新 |
