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何太平1，莫麗兒2，梁念慈1

(1廣東醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所，廣東湛江524023；

2廣東天然藥物研究與開發(fā)重點實驗室)

【摘要】目的研究大黃素對人高轉(zhuǎn)移卵巢癌HO-8910PM細胞中促肝細胞再生磷酸酶-3(PRL-3)和非類固醇抗炎藥物激活基因(NAG．1)表達的影響。方法采用Weslem blot法檢測大黃素對HO-8910PM細胞中PRL-3和NAG．1蛋白表達的影響，熒光定量實時PCR分析大黃素對HO-8910PM細胞中PRL-3和NAG-1 mRNA表達的影響。結(jié)果大黃素能明顯下調(diào)HO-8910PM細胞中PRL-3的表達，強烈上調(diào)NAG·1表達。結(jié)論大黃素影響高轉(zhuǎn)移卵巢癌細胞轉(zhuǎn)移能力可能與PRL-3和NAG一1表達有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】大黃素；卵巢腫瘤；聚合酶鏈反應(yīng)

大黃素在體外具有明顯的抗腫瘤作用，能誘導(dǎo)多種癌細胞發(fā)生凋亡作用。2007年1月一2008年3月，我們采用免疫印跡和實時熒光定量PCR方法，研究大黃素對HO一8910PM細胞中促肝細胞再生磷酸酶(PRL)和非類固醇抗炎藥物激活基因(NAG—1)蛋白表達的影響，探討大黃素影響高轉(zhuǎn)移卵巢癌細胞轉(zhuǎn)移能力的作用機制。

1材料與方法

1．1材料人高轉(zhuǎn)移卵巢癌HO-8910PM細胞。細胞在含10％小牛血清，100 U／ml青霉素和100ug/ml鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，37℃、5％CO2飽和濕度孵箱培養(yǎng)。細胞經(jīng)消化傳代，取對數(shù)生長期的細胞進行培養(yǎng)。

1．2藥品與試劑超級小牛血清；RPMI 1640培養(yǎng)基；4×上樣緩沖液(125 mmol／Tris—HCl，pH=6．8，4％SDS，10％13-巰基乙醇，20％甘油，0．04％溴酚藍)；PRL-3小鼠單克隆抗體、NAG一1兔多克隆抗體；B-actin兔IgG多抗；辣根過氧化物酶標記抗小鼠IgG、辣根過氧化物酶標記抗兔IgG。大黃素，實驗前用DMS0溶解，培養(yǎng)基稀釋，DMSO終濃度為

0．1％(實驗證明該濃度對細胞無影響)。

1．3方法

1．3．1 Western blot法取對數(shù)生長期的HO一8910PM細胞，稀釋成1×100／ml，接種于50 InlTl的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，每皿5 IIII。待細胞貼壁后，分別用0．1％DMSO和10、20、40 ktmol／L的大黃素處理HO-8910PM細胞24 h，收集細胞，PBS洗滌2次，加人預(yù)冷的細胞裂解液100斗l，用細胞刮將細胞刮下，并轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的1．5 ml離心管中，置于碎冰上冰育20 min后，于4℃，12 000 g離心15 rain。BCA法測定上清液蛋白質(zhì)含量。蛋白樣品和4 X上樣緩沖液按3：1的比例混合，100℃水中煮沸5 rain使蛋白質(zhì)變性。SDS．PAGE電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5％脫脂牛奶封閉后加入第1抗體于室溫孵育2 h，用TBS緩沖液洗滌3次，每次10 rain，加入第2抗體于室溫孵育2 h，再用TBS緩沖液洗滌3次，每次10rain，加入發(fā)光試劑顯色，以actin作內(nèi)參，用圖像分析軟件Scion Image進行光密度積分值分析。

1．3．2實時熒光定量PCR法參照實時熒光定量PCR引物設(shè)計要求，設(shè)計合成PRL一3：5-CACGCTCAGCACCTTCA，IrrG-3’．5’一GTTCCATCACCITCTGAC—CGAC-3’；NAG一1．5’一TGACrrI二TTAGCCAAAGACTGCC一3’，5’一Q氣ACCTTGAGCCCATTCCACA-3’；13-aetin：5’一CCTGTACGCCAACACAGTGC．3 7．5’-ATACTCCTGCTr．GCTGATCC-3 7。培養(yǎng)H0-8910PIVI細胞，分別用0．1％DMSO和40 lajnol／L的大黃素處理HO．8910PM細胞24 h，Trizol試劑提取總RNA，變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作流程行反轉(zhuǎn)錄實驗。配實時PCR反應(yīng)體系，置于Rotor—Cene 3000 ReahimePCR儀上進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件如下：①PRL-3：95t2，5 min；35個PCR循環(huán)(95℃，10 s；60℃，15 s；72 qc，20 s；83℃收集熒光，5 s)；②NAC一1：95℃，5 rain；35個PCIt循環(huán)(95℃，10 s；60℃，15 s；72℃，20 s；85℃收集熒光，5 s)；③B．a(chǎn)ctin：95 oC，5rain；35個PCR循環(huán)(95 oC，10 s；57 oC，15 s；72 oC，20s；85．5℃收集熒光，5 s)。為了建立PCIt產(chǎn)物的熔解曲線，擴增反應(yīng)結(jié)束后繼續(xù)從72 cC緩慢加熱到99℃(每5 s升高1℃)。根據(jù)繪制的梯度稀釋DNA標準曲線，求出樣品中PRL-3、NAG．1和13．a(chǎn)ctin的濃度，再用13一actin校正，算出樣品中PRL-3和NAC．1的相對含量。

1．3．3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 11．0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，所有數(shù)據(jù)以孑±s表示。檢驗水準a=0．05。

2結(jié)果

2．1 Western blot法檢測結(jié)果大黃素能夠明顯抑制PRL-3蛋白的表達，10、20、40 i山mol／L的大黃素處理組中PRL-3蛋白表達水平分別是對照組的(0．85±0．07)、(0．59±0．06)、(0．22±0．05)倍(P均<0．05)，見圖1；大黃素還強烈上調(diào)NAG一1蛋白表達，10、20、40 I上mol／L的大黃素處理組中NAG一1蛋白表達水平分別是對照組的(2．36±0．19)、(7．34±0．35)、(7．90±o．43)倍(P均<005)，見圖2。

2．2實時熒光定量PCR法分析結(jié)果大黃素能夠抑制PRL一3 mRNA的表達，40 i上mol／L的大黃素處理組中PRL-3 mRNA表達水平是對照組的(O．35±0．01)倍(P<0．05)；強烈上調(diào)NAG一1 mRNA表達，40 txmol／L的大黃素處理組中NAG一1 mI{NA表達水平是對照組的(10．06±0．86)倍(P<0．05)。

3討論

PRL．3是在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中起至關(guān)重要作用的蛋白酪氨酸磷酸酶。Sager等[l]提出PRL-3是抗腫瘤轉(zhuǎn)移的重要靶標之一。Ahn等[2]通過高通量篩選方法找到先導(dǎo)化合物羅丹寧，合成兩個能抑制PRL一3酶活性的羅丹寧衍生物，并初步評價它們抗腫瘤轉(zhuǎn)移效果。本文結(jié)果顯示大黃素能抑制PRL-3表達，初步證實大黃素在體外能抑制高轉(zhuǎn)移卵巢癌細胞的轉(zhuǎn)移相關(guān)能力與PRL-3表達有關(guān)，但其影響PRL一3表達的作用機制還不清楚，是否抑制PRL一3酶活性也有待進一步證實。NAG．1是TCF一13超家族的成員之一，又名巨噬細胞抑制因子一l、胎盤轉(zhuǎn)化生長因子一13、前列腺衍生因子、生長分化因子15和胎盤骨形態(tài)發(fā)生蛋白。研究表明NAG-l高表達具有抗腫瘤作用，NAG-1能抑制多種癌細胞株的生長增殖。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，NAG—l在結(jié)腸癌和惡性膠質(zhì)瘤細胞中過表達可抑制裸鼠移植瘤的形成口J。新近NAG一1被發(fā)現(xiàn)與腫瘤凋亡有密切的關(guān)系，過表達NAG．1能引起多種腫瘤細胞如結(jié)直腸癌、肺癌、口腔癌、胃癌細胞和大腸癌等癌細胞的凋亡。Liu等H1研究發(fā)現(xiàn)NAG一1能激活前列腺癌細胞DU一145細胞caspase一3表達而誘導(dǎo)凋亡。Shim等口。通過siRNA抑制TPA誘導(dǎo)NAG．1表達，可阻斷TPA誘導(dǎo)的LNCaP細胞凋亡。NAG—l促腫瘤細胞凋亡作用在持續(xù)表達NAG一1的轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)實驗中得到了驗證舊o。由于NAG一1是TGF．13超家族的成員之一，研究表明TGF一13信號通路與腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)，“u等研究還發(fā)現(xiàn)NAG．1在體外能減少腫瘤細胞一細胞外基質(zhì)和腫瘤細胞一腫瘤細胞之間的黏附能力，并促進腫瘤細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)大黃素能上調(diào)NAG-1在該細胞中的表達，從而可解釋大黃素誘導(dǎo)NAG一1高表達能抑制卵巢癌細胞轉(zhuǎn)移能力，但具體的作用機制有待更深入的研究�？傊�，大黃素抑制高轉(zhuǎn)移卵巢癌轉(zhuǎn)移相關(guān)能力與PRL．3和NAG一1的表達相關(guān)。

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