高效液相色譜同時測定紅直獐牙菜5 種有效成分的含量 | 高效液相色譜同時測定紅直獐牙菜5 種有效成分的含量 |
| 發(fā)布時間:2010-09-16 信息來源:admin 發(fā)布人:admin 點擊次數(shù):2432 |
趙旭升, 林鵬程* ( 青海民族學(xué)院藥學(xué)系, 青海西寧810007) 摘要 對紅直獐牙菜中番木鱉酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、芒果苷、當(dāng)藥醇苷采用ZORBAX SB- C18( 250 mm×4 .6 mm,5 μm) 色譜柱, 以流動相甲醇和水( 含0 .04 %磷酸) 的比例在0 ～45 min 內(nèi)由20∶80 至45∶55 線性梯度洗脫, 檢測波長254 nm, 柱溫35 ℃, 流速1 ml/ min。結(jié)果顯示,5 種化學(xué)成分均達(dá)到基線分離, 各成分都有較寬的線性范圍和良好的線性關(guān)系�？梢�, 該方法測定中藥材成份含量快速, 結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。 關(guān)鍵詞 反相高效液相色譜; 有效成分; 龍膽科; 紅直獐牙菜 青藏高原龍膽科( Gentianaceae) 植物是藏醫(yī)用來治療肝、膽疾病的藥物[ 1] 。其主要化學(xué)成分有番木鱉酸( Loganic acid) 、獐牙菜苦苷( Swertiamarin) 、龍膽苦苷( Gentiopicroside) 、芒果苷( Mangiferin) 、當(dāng)藥醇苷( Swertianolin) 等[ 2] �，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明, 番木鱉酸具有一定的抗炎活性, 對角叉菜膠引起的小鼠腳腫脹和十四烷佛波醇乙脂引起的小鼠耳腫脹抑制率達(dá)44 .4 %[ 3] ; 獐牙菜苦苷具有提高皮膚機能、促進(jìn)毛發(fā)生長、抑制中樞神經(jīng)、鎮(zhèn)痛和抗炎等作用[ 4] ; 龍膽苦苷具有促進(jìn)胃液分泌、抗原蟲和抗炎作用[ 5] ; 芒果苷具有抑制中樞神經(jīng)、抗炎、抗結(jié)核、利膽等療效[ 4] ; 當(dāng)藥醇苷具有降血糖、保 肝、抗菌、抗瘧疾、治療心血管疾病、抗氧化性等作用[ 6] 。對龍膽科植物中龍膽苦苷的測定方法主要有薄層掃描和高效液相色譜法[ 7 - 8] , 但關(guān)于龍膽科植物中番木鱉酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、芒果苷和當(dāng)藥醇苷同時測定的方法未見報道。筆者建立了用反相高效液相色譜法同時測定上述5 種化學(xué)成分含量的方法, 對評價藥材質(zhì)量、充分利用藥物資源有重 要意義。 1 材料與方法 1 .1 材料紅 直獐牙菜( Swerti a erythrotict a Maxim.) ,2005 年8 月采于青海省互助北山林場。樣品由中國科學(xué)院西北高原生物研究所胡鳳祖副研究員鑒定。樣品陰干后粉碎過80 目 篩, 冷藏保存。 1 .2 儀器與試劑Agilent1100 高效液相色譜儀, 配置為手動進(jìn)樣器、在線脫氣機、高壓二元梯度泵、恒溫柱溫箱、DAD 檢測器、Agilent1100 色譜工作站、ZORBAX SB-C18( 250 mm×4 .6mm,5 μm) 色譜柱;KQ3200 超聲波清洗器, 昆侖市超生儀器有限公司;SZ- 97 自動三重純水蒸餾器, 上海亞榮生化儀器廠。甲醇為高效液相色譜專用試劑, 山東禹王實業(yè)有限公司禹城化工廠; 水為自制三重蒸餾水; 磷酸為AR 級, 北京紅星化工廠獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、芒果苷對照品購于中國生物制品鑒定檢驗所; 番木鱉酸對照品由青海普蘭特藏藥研究所孫洪發(fā)研究員提供; 當(dāng)藥醇苷對照品由中國科學(xué)院西北高原生物研究所胡鳳祖副研究員提供。經(jīng)歸一化測試, 以上對照品純度均大于98 .5% 。 1 .3 對照品儲備液的配制精確稱取對照品番木鱉酸2 .50mg 、龍膽苦苷1 .27 mg 、獐牙菜苦苷2 .90 mg 、芒果苷2 .40 mg 和當(dāng)藥醇苷2 .2 mg 分別置1 ml 容量瓶中, 以甲醇溶解并定容,配制成相應(yīng)濃度的對照品儲備液, 使用時稀釋成所需濃度。 1 .4 樣品溶液的制備分別精確稱取粉碎至80 目的待測樣品, 每份0 .5 g , 分別加入15 ml 甲醇室溫超聲提取40 min, 定容于25 ml 容量瓶, 過0 .45 μm 濾膜, 在選定色譜條件下測定峰面積。 2 結(jié)果與分析 2 .1 色譜條件的選擇色 譜柱為ZORBAX SB-C18( 250 mm×4 .6 mm,5 μm) , 流動相為甲醇和水( 含0 .04% 磷酸) 在0 ～45min 內(nèi)由20∶80 至45∶55 梯度洗脫, 流速1 ml / min, 檢測波長254 nm, 柱溫35 ℃, 在該色譜條件下5 種有效成分均達(dá)到基線分離。圖1 表明, 番木鱉酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、芒果苷、當(dāng)藥醇苷的保留時間分別為11 .11 、13 .54 、15 .88 、18 .77 、41 .63 min。 2 .2 線性關(guān)系的考察精確量取番木鱉酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、芒果苷、當(dāng)藥醇苷5 種對照品儲備液, 以甲醇配制濃度分別為: 番木鱉酸0 .125 、0 .050 、0 .025 、0 .016 7 、0 .012 5 、0 .010 mg/ ml ; 獐牙菜苦苷0 .580 、0 .290 、0 .145 、0 .058 、0 .029 、0 .019 mg/ ml ; 龍膽苦苷0 .625 、0 .245 、0 .122 、0 .024 5 、0 .012 2 、0 .098 mg/ ml ; 芒果苷0 .600 、0 .024 、0 .120 、0 .024 、0 .004 8 、0 .001 2 mg/ ml ; 當(dāng)藥醇苷0 .008 8 、0 .013 2 、0 .017 6 、0 .022 、0 .026 4 、0 .035 2 mg/ ml 的混合對照品標(biāo)液系列溶液。每次進(jìn)樣5 μl , 以峰面積的積分值定量。試驗發(fā)現(xiàn), 番木鱉酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、芒果苷、當(dāng)藥醇苷的回歸方程分別為A=609 .13 X+ 0 .93 、A= 667 .07 X + 22 .48 、A= 1 007 .73 X + 33 .40 、A= 3 247 .87 X- 7 .20 、A= 4 714 .04 X - 63 .56 ; 相關(guān)系數(shù)分別為0 .999 9 、0 .999 8 、0 .999 9 、1 .000 0 、0 .999 3 ; 線性范圍分別為0 .05 ～0 .625 、0 .009 5 ～2 .9 、0 .048 6 ～2 .56 、0 .005 6 ～2 .8 、0 .044 ～0 .154 μg 。 2 .3 檢測限的確定在“2.1”色譜條件下, 當(dāng)信噪比S/ N = 3 時, 對各組分最低檢測限進(jìn)行測定。結(jié)果表明, 番木鱉酸、 獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、芒果苷、當(dāng)藥醇苷的最低檢測限分別 為1 .25 、0 .56 、0 .50 、0 .48 、0 .65 ng 。
2 .4 精密度試驗取 含0 .025 mg/ ml 番木鱉酸、0 .058 mg/ ml獐牙菜苦苷、0 .024 5 mg/ ml 龍膽苦苷、0 .024 mg/ ml 芒果苷、0 .022 mg/ ml 當(dāng)藥醇苷混合對照品溶液, 在“2 .1”色譜條件下測定色譜峰的峰面積, 計算得RSD 分別為0 .72% 、0 .90% 、0 .69 % 、0 .93% 、1 .12 %( n = 6) , 表明儀器精密度良好。 2 .5 重復(fù)性試驗精 確稱取6 份0 .500 g 紅直獐牙菜樣品,按“1.4”項下方法操作, 在“2 .1”色譜條件下測定番木鱉酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、芒果苷、當(dāng)藥醇苷的含量, 計算得RSD分別為2 .4 % 、1 .4% 、2 .0% 、2 .9 % 、3 .1%( n =6) , 表明方法重復(fù)性良好。 2 .6 穩(wěn) 定性試驗精 確稱取紅直獐牙菜樣品0 .500 g , 按“1.4”項下方法操作, 分別在0 、2 、4 、6 、8 h 時進(jìn)樣, 測定番木鱉酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、芒果苷、當(dāng)藥醇苷的峰面積, 計算得其RSD 分別為1 .4% 、1 .8% 、1 .0% 、2 .1% 、2 .4%( n = 5) 。這表明樣品溶液在8 h 內(nèi)穩(wěn)定。 2 .7 回收試驗精確稱取3 份已測知含量的紅直獐牙菜樣品各0 .05 g , 添加各對照品溶液適量( 0 .80 ml 0 .25 mg/ ml 番木鱉酸溶液、0 .70 ml 0 .19 mg/ ml 獐牙菜苦苷溶液、0 .60 ml 0 .245 mg/ ml 龍膽苦苷溶液、0 .20 ml 0 .14 mg/ ml 芒果苷溶液、0 .10 ml 0 .022 mg/ ml 當(dāng)藥醇苷溶液) , 按“1.4”項下方法操作,測得番木鱉酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、芒果苷、當(dāng)藥醇苷的平均回收率( n = 3) 分別為102 % 、97 .7% 、99 .5% 、103% 、101% ; RSD 分別為4 .4% 、4 .3% 、3 .5 % 、1 .1% 、4 .1 % 。 2 .8 紅直獐牙菜中有效成分的測定取“1.4”項下制備的樣品溶液按“2.1”色譜條件進(jìn)行分析, 經(jīng)DAD 檢測器檢測以上5 種待測組分的峰純度, 且待其紫外光譜與對照品一致后, 按外標(biāo)法以峰面積積分值計算, 得5 種有效成分的百分含量( 每個樣品重復(fù)進(jìn)樣3 次, 取平均值) 為番木鱉酸0 .522 % 、龍膽苦苷1 .52 % 、獐牙菜苦苷0 .214 % 、芒果苷0 .023 1 % 、當(dāng)藥醇苷0 .138% 。 3 討論 3 .1 檢測波長的確定對照品溶液進(jìn)樣后, 利用DAD 檢測器在200 ～400 nm 掃描其吸收光譜, 對照品在254 nm 波長處有較高的吸收峰, 選擇該波長為檢測波長。 3 .2 提 取方法確定參 照文獻(xiàn)[ 9] , 比較了不同提取方法( 超聲和熱回流) 、提取時間( 15 、30 、45 、60 min) 對提取率的影響, 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 超聲提取法優(yōu)于熱回流提取法, 且超聲提取30min 即可將有效成分提取完全, 故該試驗采用超聲提取法。 3 .3 流動相的選擇番 木鱉酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、芒果苷、當(dāng)藥酵苷的色譜峰易拖尾。試驗發(fā)現(xiàn), 在水中加入0 .04 %( V/ V) 磷酸時可改善番木鱉酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、芒果苷、當(dāng)藥醇苷的峰形。故選擇甲醇和含0 .04% 磷酸的水作流動相。 4 結(jié)論 該試驗建立的高效液相色譜法具有簡便、快速, 結(jié)果準(zhǔn)確、可靠等優(yōu)點, 對評價藥材質(zhì)量、充分利用藥物資源有重要意義。 參考文獻(xiàn) [1] 紀(jì)蘭菊, 孫洪發(fā), 丁經(jīng)業(yè). 青藏高原四種龍膽植物化學(xué)成分初步研究[ C] / / 中國科學(xué)院西北高原生物研究所. 高原生物學(xué)集刊,1992 . [2] 李玉林, 丁晨旭, 劉健全. 紅直獐牙菜的苷類成分[J] . 中草藥,2002, 33(2) :104 - 106. [3] RECIOMC, GINER R M, MANEZ S, et al . Structural considerations onthe iridoids as anti-inflammatory agents[J] . Planta Med , 1994 ,60(3) :232 - 234 . [4] 孫文基, 繩金房. 天然活性成分簡明手冊[ M] . 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社,1998:539 ,256 ,367 . [5] 宮川辰治, 大島俊幸, 平山纟總良. 龍膽科2 種苦苷的含量測定[J] . 藥物分析雜志,1997 ,17(4) :241 - 243. [6] 楊雁賓. 天然產(chǎn)物酮類化合物[J] . 云南植物研究,1980 , 2( 3) : 345 -369 . [7] 胡鳳祖, 宋婭莉, 劉梅. 青藏高原龍膽科植物藥用有效成分的高效液相色譜分析[J] . 色譜,2003 ,23(1) :63- 65. [8] 高光躍, 李鳴, 馮毓秀.11 種獐牙菜及近緣植物中有效成分的高效液相色譜測定[J] . 藥學(xué)學(xué)報,1994 ,29(12) :910- 914 . [9] 林鵬程, 冶兆輝, 盧永昌, 等.HPLC 法測定獐牙菜及其近緣植物中4 種有效成分的含量[J] . 藥物分析雜志,2004 ,24(5) :502 - 505. 產(chǎn)品鏈接： 杜仲提取物 綠原酸 金銀花提取物 苦杏仁苷 枇杷葉提取物-熊果酸 大花紫薇提取物-科羅索酸 上禾生物 專注植提 精于高純 基于您對天然產(chǎn)物需求持續(xù)創(chuàng)新 |
