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金銀花中綠原酸一步提取法及綠原酸抗菌活性

(1. 衡陽師范學(xué)院化學(xué)與材料科學(xué)系,湖南衡陽421008 , 2 南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院, 湖南衡陽421001)

摘　要:以乙酸乙酯和0. 05 molPLHCl 組成的混合溶液作萃取劑,從金銀花中一步提取綠原酸,并研究了乙酸乙酯的體積分?jǐn)?shù)、溫度、浸取時(shí)間對提取綠原酸的影響和綠原酸的抗菌活性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果:提取綠原酸最佳實(shí)驗(yàn)條件是:溫度65°C ,乙酸乙酯的體積分?jǐn)?shù)0. 8 ,浸取時(shí)間3 h。提取物與金銀花質(zhì)量比為3. 21 % ,綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)86. 3 %;同時(shí)測得綠原酸抗金黃色葡萄球菌的活性比抗大腸桿菌強(qiáng)。

關(guān)鍵詞:金銀花; 乙酸乙酯; 提取; 綠原酸; 抗菌活性  綠原酸生產(chǎn)企業(yè)上禾生物

金銀花(Flos lonicerae) 是我國民間常用中草藥,其味甘性寒,具有清熱解毒功能[1] 。近年研究發(fā)現(xiàn):金銀花還具有抗HIV 病毒和抗腫瘤等作用[2] 。中醫(yī)藥理研究表明:金銀花的主要藥物活性成分是綠原酸(Chlorogenic acid 上禾生物 ) [3] ,其化學(xué)式C16H18O9 ,結(jié)構(gòu)式為:

綠原酸除醫(yī)用外,還廣泛用于食品保鮮劑和化妝品的抗衰老劑。具有十分廣闊的應(yīng)用前景[4 ,5 ] 。因而許多研究者對提取綠原酸產(chǎn)生極大興趣,目前,國內(nèi)報(bào)道綠原酸的提取工藝主要有稀醇法、水浸醇沉法和水提法等方法,這些提取方法得到的綠原酸純度低[6 ,7 ] ,要得到較純的樣品還需要進(jìn)行提純,如乙酸乙酯萃取提純法[8 ] 。提取周期長、溶劑用量大、成本偏高。鑒于以上原因,筆者在前人研究的基礎(chǔ)上,探討了乙酸乙酯一步法從金銀花中提取綠原酸,

簡化了提取工藝,并且提高了提取物中綠原酸的相

對含量,是一項(xiàng)具有實(shí)用價(jià)值的方法。

1 　實(shí)驗(yàn)部分

1. 1 　材料與儀器

金銀花購于衡陽市敬一堂大藥房中藥部;甲醇、乙酸乙酯、鹽酸(用蒸餾水配成0. 05 molPL 的稀溶液備用) 均為分析純試劑(上�；瘜W(xué)試劑公司) ;試驗(yàn)菌種(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌) 由南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院提供,濃度為5000 萬個PmL ,經(jīng)稀釋后為10 萬個PmL 備用。UV22501 型紫外分光度計(jì)(日本島津) ;PR252AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠) ;恒溫水浴(河南英谷恒溫器廠) ;回流提取器(自組裝) 。

1. 2 　實(shí)驗(yàn)方法

1. 2. 1 　綠原酸的提取

綠原酸是一種有機(jī)弱酸,在低酸度溶液中其電離過程被抑制,主要以分子形式存在,有利于用乙酸乙酯進(jìn)行液2液萃取[9] 。本工作用乙酸乙酯和稀鹽酸混合溶液作提取劑,從金銀花中提取綠原酸,水是綠原酸溶出劑,鹽酸是電離抑制劑,乙酸乙酯是萃取劑。稱取30 g 金銀花(研成粉末) ,加入240 mL 乙酸乙酯和60 mL 0. 05 molPL 鹽酸,在65°C水浴上攪拌回流浸取3 h ,重復(fù)提取2 次(重復(fù)提取實(shí)驗(yàn)鹽酸用量每次遞減20 mL) ,趁熱過濾,合并濾液分離出乙酸乙酯,用水洗滌,減壓回收溶劑濃縮得到膏狀物,用蒸餾水溶解膏狀物過濾除雜,濾液在水浴上緩慢蒸發(fā)至干,真空干燥至恒重。

1. 2. 2 　綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定

采用分光光度法測定提取物中綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù),準(zhǔn)確稱取40 mg 提取物,用甲醇溶解,在100 mL容量瓶中定容,經(jīng)過適當(dāng)稀釋,以甲醇作參比,用分光光度計(jì),在324 nm 下測定溶液的吸光度,將吸光度值代入文獻(xiàn)[8 ]綠原酸標(biāo)準(zhǔn)樣品吸光度曲線方程中,計(jì)算提取物中綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2 　結(jié)果與討論

2. 1 　乙酸乙酯體積分?jǐn)?shù)對提取綠原酸的影響在乙酸乙酯一步法中,酯是萃取劑,鹽酸水溶液是浸取劑,乙酸乙酯與稀鹽酸的體積比對提取綠原酸有較大的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

從表1 結(jié)果可見:乙酸乙酯體積分?jǐn)?shù)較高時(shí),水所占比例少不利于金銀花的溶脹,綠原酸難以浸入液相,提取物的質(zhì)量減少,提取率下降,反之,鹽酸水溶液體積分?jǐn)?shù)高時(shí),浸取雜質(zhì)的種類及含量都增加,造成分離過程綠原酸損失大,得率降低,根據(jù)實(shí)驗(yàn)綜合效果乙酸乙酯體積分?jǐn)?shù)為0. 8 時(shí)比較理想,提取物與金銀花的質(zhì)量比為3. 17 % ,綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

86. 4 %。

2. 2 　溫度對提取綠原酸的影響

綠原酸易溶于水,但當(dāng)溫度降低時(shí),溶解性變差,所以溫度太低不利綠原酸的溶出,但溫度過高時(shí),會導(dǎo)致綠原酸分解,不同溫度對提取綠原酸影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

2. 3 　綠原酸得率與提取時(shí)間的關(guān)系

在乙酸乙酯一步法提取綠原酸過程中,存在溶解和萃取平衡,提取時(shí)間太短,溶解和萃取均未達(dá)到平衡,綠原酸得率低。提取時(shí)間過長,提取率幾乎不再增加,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

2. 4 　綠原酸提取方法比較

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表4) 可見:乙酸乙酯一步萃取法明顯優(yōu)于其它方法。

2. 5 　綠原酸抑菌活性試驗(yàn)

采用平板法測試綠原酸對革蘭氏陰性菌(大腸桿菌) 和革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌) 的抑菌能力。培養(yǎng)皿和實(shí)驗(yàn)器材均經(jīng)高溫滅菌處理2 h ,普通肉湯瓊脂培養(yǎng)基用稀堿調(diào)節(jié)pH為7 . 2～7 . 4 ,經(jīng)121°C滅菌處理30 min ,取15 mL 培養(yǎng)基傾入平皿中冷卻至室溫,將1 mL 菌液平鋪于平板中涂抹均勻,并在每只平板內(nèi)放入4 只鋼圈,鋼圈內(nèi)準(zhǔn)確加入一定劑量的藥物及0. 2 mL 生理鹽水。以上所有操作均在100 級凈化臺上進(jìn)行。然后在37°C培養(yǎng)箱中培

養(yǎng)24 h ,測量抑菌圈的面積,結(jié)果以抑菌圈直徑表示,取3 次試驗(yàn)平均值列于表5 中。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出;綠原酸對革蘭氏陰性菌(大腸桿菌) 和革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌) 均有抑菌活性。但抗金黃色葡萄球菌的活性比抗大腸桿菌活性更強(qiáng),與文獻(xiàn)[10 ] 結(jié)果一致。

3           結(jié)論

乙酸乙酯一步法從金銀花中提取綠原酸的最佳實(shí)驗(yàn)條件為:乙酸乙酯體積分?jǐn)?shù)0. 8 ;提取時(shí)間3 h ;溫度65°C。提取物與原料質(zhì)量比3. 21 %;綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)86. 3 %。如果進(jìn)一步提純可得到高純綠原酸;綠原酸抗金黃色葡萄球菌活性比抗大腸桿菌活性更強(qiáng)。

參考文獻(xiàn):

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[7] 　劉祥蘭,劉重芳,張　英. 綠原酸提取工藝的比較研究[J ] . 中成藥,2000 ,22(6) :4022404.

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[10] 　丁學(xué)民,胡佐良,楊末芝,等. 常用中醫(yī)方藥手冊[M] .長沙:湖南科技出版社,1982.

產(chǎn)品鏈接：

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