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任秀蓮1，2，周春山1，魏琦峰1，2，肖建波1，雷啟福1，湯小勝1(1．中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南長沙410083；2．內(nèi)蒙古科技大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭014030)

摘要：目的研究苦丁茶(llex kudlingcha C．J．Tseng)中熊果酸的分離純化，建立分離純化工藝條件，以利于苦丁茶資源的開發(fā)利用。方法以熊果酸浸出率為考核指標(biāo)，采用正交實驗法考察諸因素對浸出率的影響。乙醇提取液經(jīng)沉淀富集和大孔樹脂柱色譜純化得到熊果酸，采用HPLC分析檢測。結(jié)果優(yōu)化的提取條件為：在85％水浴中，以體積分?jǐn)?shù)90％乙醇水溶液為提取溶劑，固液比為1：14，提取2次，每次提取2．5 h，熊果酸的浸出率可達(dá)到1．44％。98樹脂分離富集的最優(yōu)條件：樣品溶液熊果酸濃度l~2mg·mL-1，樣品溶液pH=6．0~7．0，吸附l h，洗脫劑pH=11．0，依次用水、4倍體積30％乙醇、4倍體積90％乙醇以2~3 mL·min-1的流速洗脫，收集90％乙醇洗脫液，熊果酸回收率為97．82％，純度為95．O％。結(jié)論該工藝產(chǎn)品純度高，收率高，可實現(xiàn)工業(yè)化。

關(guān)鍵詞：苦丁茶；分離；純化；熊果酸；大孔吸附樹脂；高效液相色譜法

熊果酸(ursolic acid，UA)是一種弱極性的五環(huán)三萜酸，具有明顯抗炎、降脂、降酶和抗癌作用，是近年新發(fā)現(xiàn)的抗癌活性成分，也是現(xiàn)代腫瘤藥物篩選的新熱點[1]。目前，熊果酸的提取分離主要采用有機溶劑萃取和硅膠柱色譜分步洗脫的方法[2~4]，這些方法的工藝流程長，收率低，且使用有毒有機溶劑。近年來，大孔吸附樹脂在藥物提取分離中顯示出越來越重要的作用[5~6]，尤其對非極性或弱極性化合物具有良好的吸附分離性能，因此，作者采用大孔吸附樹脂(macro-po．rOllS adsorption rosin，MAR)對苦丁茶中的熊果酸進(jìn)行了分離富集研究，為熊果酸的分離富集開辟新路，對熊果酸工業(yè)化生產(chǎn)有一定的指導(dǎo)意義。

1材料、試劑與儀器

1．1材料、試劑

苦丁茶，2002年采摘，廣西；50℃下烘干粉碎備用；藥材經(jīng)廣西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院中藥鑒定室鑒定為：冬青科植物苦丁茶(／／ex kud／ngcha c．J．Tseng)，藥材符合2000年版(一部)有關(guān)項下的規(guī)定。乙醇、甲醇、氫氧化鈉、硫酸等為分析純；熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司，純度為97％)；6種非極性大孔吸附樹脂(南開大學(xué)化工廠)的物理結(jié)構(gòu)參數(shù)見表1。

1．2儀器

Err 8100 HPLC．pump(Biotronik)；BT 8200 HPLC Uv／ⅥS Detector(Biotronik)；C．R3A Chromatopac(Biotronik)。

2方法

2．1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解后配制成濃度為0．804 0 mg·mL～，作為測定樣品的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2．2色譜條件

Hypersil C18色譜柱(10 gm，250 toni×4．6 mm)，流動相：甲醇．水．乙酸(90：10：0．02)，微濾膜過濾流動相后，超聲波脫氣處理20 min；檢測波長220 nm；靈敏度0．08AUFS；流速0．6 mL·min～；溫度為25℃。

2．3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確移取0．804 0 mg·mL“的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0，2．0，4．0，6．0，8．0和10．0 mL，甲醇定容至10 mL，配制成標(biāo)準(zhǔn)系列。在“2．2”項色譜條件下，吸取上述溶液，分別進(jìn)樣6血，每一個濃度重復(fù)測定6次。以濃度C(mg·mL。)為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到如下回歸方程：A=524 170c～902．5，R2=0．999 8。

2．4樣品的測定

樣品在與標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的色譜條件下測定，根據(jù)回歸方程得到樣品中熊果酸的濃度。

2．5檢測樣品的制備

將分步洗脫得到的洗脫液減壓濃縮至干，甲醇溶解，稀釋定容至10 mL，按“2．4”項下檢測，外標(biāo)法定量。

2．6大孔吸附樹脂的預(yù)處理

先用乙醇充分浸泡溶漲大孔吸附樹脂，然后以蒸餾水洗至無混濁現(xiàn)象，再用4％HCI浸泡，蒸餾水洗至無Q～存在為止。在50℃真空干燥1 d，備用。

3結(jié)果與討論

3．1正交實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果"1得出：乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、液固比(B)、提取時間(c)和提取次數(shù)都不同程度地影響著熊果酸的浸出率。當(dāng)提取次數(shù)達(dá)到3次后，浸出率變化不大。而且在實際生產(chǎn)中也不可能進(jìn)行多次提取，因此選擇的回流提取次數(shù)為2次。不同的水浴溫度(D)可以使提取液的回流速度不同，從而影響浸出率。因此正交實驗以乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比、提取時間和提取溫度4因素確定[8]，正交實驗因素與水平選擇見表2，熊果酸浸出率的正交實驗及計算結(jié)果見表3。方差分析見表4。

從表3，4可知，提取時間顯著影響熊果酸的浸出率，乙醇體積數(shù)和液固比對浸出率有一定的影響，提取溫度在85～95℃范圍內(nèi)對浸出率沒有明顯影響。由正交實驗結(jié)果可以得到最佳提取條件為A3＆C2 Dl，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為90％，液固比為14．回流時間為2．5 h，回流溫度為85℃。在該條件下，熊果酸的浸出率可達(dá)到1．44％。

3．2熊果酸的富集

“3．1”項下苦丁茶提取液用20％NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH=9～11，除去大分子雜質(zhì)，所得濾液用10％颶s04酸化至pH=1。2，過濾所得沉淀，水洗至近中性，50℃真空干燥，得到熊果酸富集物。、采用“2．4”項下方法分析其中的熊果酸純度為28．05％。

3．3大孔吸附樹脂對熊果酸吸附性能的研究

3．3．1大孔吸附樹脂對熊果酸的靜態(tài)吸附性能分別稱取6種大孔吸附樹脂8 g，按“2．6”項下方法對樹脂進(jìn)行預(yù)處理，濕法裝柱。甲醇溶解熊果酸富集物，濃度為1．3l mg·ml-1，再用極性調(diào)節(jié)劑以1：1稀釋后上柱，靜態(tài)吸附1 h后，先以H20洗至無色，再以90％乙醇洗脫至無三萜反應(yīng)[9]，按“2．5”項下方法處理洗脫液，結(jié)果見表5。

從表5可知，D8，聵樹脂對熊果酸的吸附量較高，而XAI)-2樹脂最低，但試驗表明：XAD-2樹脂吸附雜質(zhì)的能力很強，而XAD-5，XAD-I樹脂對熊果酸的吸附能力較強，90％乙醇洗脫時很難使熊果酸解吸完全，洗脫速度明顯比其它4種樹脂慢。因此，選擇聵，馬樹脂富集熊果酸，XAD-2樹脂純化熊果酸進(jìn)行研究。從幾種樹脂的主要技術(shù)參數(shù)分析，粒徑為0．6~1．42 mm的樹脂適合于富集熊果酸，而粒徑為0．35～1．30 mm的樹脂不適合于富集熊果酸。

3．3．2洗脫劑種類的選擇根據(jù)綠色清潔工藝的要求，采用乙醇．水體系為洗脫劑不僅避免了以往硅膠柱色譜富集熊果酸時有毒有機溶劑的使用，而且乙醇回收后可以重復(fù)使用，降低了生產(chǎn)成本，為產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供了保證。因此，本研究選用乙醇一水為洗脫劑。

3．3．3吸附時間的確定精確稱取經(jīng)預(yù)處理活化的D8大孔

吸附樹脂1．000 g于100 mL燒杯中，以熊果酸含量為1．05mg·mL。1的樣品30 mL加入到燒杯中，吸附20，30，45，60，90和120 min后依次取樣，按“2．4”項下分析方法檢測，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，20 min以前吸附速度較快，隨著吸附時間的延長，吸附速度越來越慢，直到平衡，所以吸附時間以1 h為宜。

3．3．4洗脫劑濃度的選擇域樹脂8 g，按“3．3．1”項下方法吸附后，采用水、10％乙醇、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇各200 mL分步洗脫，收集洗脫液，按“2．5”及“2．4”項下的方法制備樣品與測定，結(jié)果見表6。

由表6可知，水一30％乙醇不能洗脫熊果酸。隨著洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，洗脫能力逐漸增強，70％乙醇對熊果酸有一定的洗脫能力，90％乙醇的洗脫能力最強，為70％乙醇洗脫劑的5倍。在洗脫過程中。如果洗脫劑分子與吸附樹脂的親合力大于目標(biāo)物質(zhì)與吸附樹脂的親和力，就可以將該目標(biāo)物質(zhì)置換而洗脫下來。因此，洗脫時，先用與吸附劑親合力小的溶劑，然后逐漸改變洗脫劑的極性，將與吸附劑親和力更強的物質(zhì)洗脫下來，以達(dá)到良好的分離效果。本實驗采用D型非極性大孔吸附樹脂為吸附劑，乙醇．水為洗脫劑，因此，洗脫劑的極性越強，洗脫能力越弱；洗脫劑的極性越弱，洗脫能力越強。這與高效液相色譜檢測所選流動相的組成是一致的。

3．3．5樣品溶液pH的選擇甲醇溶解熊果酸富集物，再用極性調(diào)節(jié)劑以1：I稀釋，分別調(diào)節(jié)樣品溶液的pH為2．87，4．64，7．07，9．23，II．25后，D8樹脂柱靜態(tài)吸附l h，水洗至無色，30％乙醇、90％乙醇各200 mL洗脫，收集90％乙醇洗脫液，洗脫液按“2．5”項下方法處理，結(jié)果見圖2。

從圖2可以看出，當(dāng)樣品溶液的pn=7．07時，樹脂對熊果酸的吸附量最大，柱后流出液中熊果酸的含量最小，因此，選擇樣品溶液pH為6—7有利于熊果酸的吸附。當(dāng)pH>

7．07時，熊果酸的吸附量逐漸下降，主要是因為熊果酸酸根離子的濃度增大，從而增大了熊果酸在洗脫劑中的溶解度，減小了與大孔吸附樹脂的作用力，不利于吸附。實驗中觀察到，當(dāng)樣品溶液的pH為2．87，4．64時，水洗脫時有三萜酸沉淀析出，因此，酸度過低也不利于熊果酸的吸附。

3．3．6洗脫劑pH的選擇平行裝5根D8樹脂柱分別命名為1，2，3，4，5，取濃度為1．31 nag·mL“熊果酸富集物溶液10．00 mL，10．00 mL極性調(diào)節(jié)劑稀釋后，調(diào)節(jié)pn=6．58，上樣，靜態(tài)吸附1 h后，分別水洗至無色，30％乙醇200 mL洗脫，再分別用pH=7，9，10，11，12，13的90％乙醇洗脫劑200mL洗脫至無三萜反應(yīng)，控制洗脫流速為2—3 mL·min～，將90％乙醇洗脫液酸化至pn：4．0，過濾，所得沉淀水洗至中性后，甲醇溶解定容至10．00 mL，按“2．4”項下分析方法檢測，外標(biāo)法定量，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，洗脫劑pH對洗脫能力有顯著的影響u[10]。隨著洗脫劑堿性的增強，洗脫能力逐漸增強，當(dāng)洗脫劑pH≥11時，洗脫能力達(dá)到最大值。因此，選擇洗脫劑pH=11為宜。這是因為，通過改變洗脫劑pH值，使熊果酸以離子型存在，很容易被洗脫下來，從而提高了洗脫率。當(dāng)洗脫劑pH≥11時，熊果酸的回收率可達(dá)gr7．82％，純度可達(dá)95．0％。

“2．4”項下色譜條件下，對D8樹脂吸附后的產(chǎn)品進(jìn)行分析，結(jié)果見圖4�？梢姡珼8樹脂可以有效地純化熊果酸。采用XAD-2樹脂進(jìn)一步進(jìn)行純化可以獲得更高純度的產(chǎn)品。

4結(jié)論

在85℃水浴中，以體積分?jǐn)?shù)90％乙醇水溶液為提取溶劑，固液比為l：14，提取2次，每次提取2．5 h，熊果酸的浸出率可達(dá)到1．44％。大孔吸附樹脂可以成功應(yīng)用于苦丁茶中熊果酸的分離與富集，可以大幅度地提高熊果酸的收率和純度。乙醇．水洗脫液的使用避免了傳統(tǒng)工藝中有毒有機溶劑引起的2次污染，使分離純化工藝安全、高效和低成本。pH對熊果酸在大孔吸附樹脂上的吸附與洗脫有明顯的影響，通過調(diào)節(jié)pH=6~7，可以成功使熊果酸吸附，調(diào)節(jié)pH≥ll可使熊果酸洗脫完全。

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