999国内精品视频免费_国产真人作爱免费视頻_口口亚洲国产综合Av_99Re国产精品视频

劉靜

(陜西教育學(xué)院生命科學(xué)系，陜西西安710061)

摘要：通過測定杜仲葉提取物對0₂^- 和·OH的清除率，對小鼠紅細(xì)胞氧化溶血的影響和對各臟器MDA生成的抑制率，評價杜仲葉提取物的體外抗氧化作用。實驗結(jié)果表明，杜仲葉提取物具有明顯的體外抗氧化作用。

關(guān)鍵詞：杜仲葉；體外抗氧化；自由基

杜仲(Eucommla ulmiodes Olives)為被子植物門杜仲科(Eucommiaceae)杜仲屬落葉喬木，是一種名貴藥材�！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品，它具有補(bǔ)中益氣、堅筋骨、強(qiáng)志、安胎……久服輕身耐老之功效。長期以來，人們都以杜仲皮入藥，近年來的研究表明 [1,2,3]，杜仲葉與皮具有相似的化學(xué)成分和藥理作用，可代皮供藥用。為了開發(fā)利用這一天然資源，我們對杜仲葉的體外抗氧化作用進(jìn)行了實驗研究。

1 材料與方法

1．1 材料

杜仲葉：采自秦嶺山區(qū)，提取液由陜西教育學(xué)院生命科學(xué)系生化實驗室制備。

1．2 動物

1月齡的ICR小鼠，體重20±2克，雌雄兼用。由陜西省中醫(yī)藥研究院實驗動物中心提供(陜醫(yī)動字08—004號)。

1．3 實驗方法

1．3．1 對0₂^-的清除率的測定[4]

每支試管加入3mlTris—HC1緩沖液(pH8．2)，0．1ml不同藥液或溶媒，25℃ ±0．5℃水浴平衡20min后，加入0．3ml7mmo1．L 的鄰苯三酚，準(zhǔn)確反應(yīng)4min，各加入lml lOmo1．L^-1 HC1終止反應(yīng)，420nm測A值，計算清除率。

1．3．2 對·OH清除率的測定[5]

用FeSO4+H2O2產(chǎn)生·OH，以·OH氧化水楊酸鈉所得產(chǎn)物的吸光值表示·OH的多少，吸光值越大，·OH越多。3ml反應(yīng)液中含0．15mmo1．L-1。FeSO4，6mmol-1．L H2O2，2mmo1．L-1 水楊酸鈉及不同濃度的藥物，最后加H202啟動反應(yīng)，37℃反應(yīng)1h，測510nm吸光值，吸光值越低，清除·OH效果越好。

1．3．3 對小鼠紅細(xì)胞氧化溶血的影響[6]

小鼠眼眶取血分離紅細(xì)胞，生理鹽水洗3次后制成0．5％懸液。取紅細(xì)胞懸液lml，加不同濃度的杜仲葉提取液，最后加100mmo1．L H2O2混勻，37*℃溫浴1h，用生理鹽水稀釋5倍，lO00g離心10rain，取上清液于415nm 比色測定，以對照組為100％溶血，計算溶血度。

1．3．4 丙二醛(MDA)含量的測定

組織勻漿制備：用引頸法處死小鼠，迅速取其肝、心組織，冰浴下勻漿，制成5％的懸液。

肝亞細(xì)胞制備：肝組織于冰浴下以0．25mo1．L 蔗糖緩沖液制成10％勻漿，l000g離心10min，沉淀用預(yù)冷的0．25mo1．L 蔗糖緩沖液洗2次，合并上清液，以10000g離心20rain，沉淀用0．25mo1．L 的蔗糖緩沖液洗2次，合并上清液，所得沉淀即為純化的線粒體[7]。

MDA的測定[5]：取lml組織勻漿液或肝亞細(xì)胞懸液，加入不同濃度的杜仲葉提取物，再加入6mmo1．L-1。FeSO4100ul，最后加60mmo1．L-1H202 40ul。在37℃下，水浴1h后，加入15％TCA lml結(jié)束反應(yīng)，再加入0．67％TBA lml，于沸水浴中顯色15min，冷卻后離心，測532nm吸光度，以吸光度表示MDA含量多少，吸光值越大，MDA含量越高。

2 結(jié)果與討論

進(jìn)行體外實驗可以排除體內(nèi)實驗的復(fù)雜性，如藥物在體內(nèi)的分解、代謝、吸收、轉(zhuǎn)化等，藥物與體內(nèi)物質(zhì)如抗氧化酶、微量元素等的相互作用，藥物有效成分的利用度等各種問題，從而能夠更為直接地觀察藥物的治療效果，為藥物的體內(nèi)實驗提供實驗依據(jù)，對于闡明藥物的作用機(jī)制有一定幫助。

2．1 對0₂^-的清除率

0₂^-是活性氧的一種，是機(jī)體內(nèi)壽命最長的自由基，通常作為自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引發(fā)劑，產(chǎn)生活性更強(qiáng)的自由基，在體內(nèi)由過氧化物歧化酶清除。如果體內(nèi)過氧化物歧化酶活力下降或0₂^-產(chǎn)生過量都會給機(jī)體造成危害。本實驗通過鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生0₂^-，來觀察杜仲葉提取物在體外對0₂^-有無抑制或清除作用，結(jié)果如表1所示。

由表1結(jié)果顯示，加藥組的A420nm值均低于對照組，表明杜仲葉提取物可以清除0₂^-或使0₂^-的生成減少，當(dāng)杜仲葉提取物的濃度達(dá)到8．00ug／ml時效果顯著。

2．2 對·OH的清除率

·OH是氧化性極強(qiáng)的氧化劑，不僅是膜脂質(zhì)過氧化的罪魁禍?zhǔn)祝�它還一直被認(rèn)為是引起DNA損傷的重要因素。本實驗測定杜仲葉提取物在體外對·OH有無抑制作用，結(jié)果如表2

所示。

表2結(jié)果顯示，杜仲葉提取物各劑量組的A510nm值均小于對照組，數(shù)據(jù)差異極顯著，說明杜仲葉提取物對·OH有良好的清除作用，且有一定的量效關(guān)系。

2．3 杜仲葉提取物對小鼠紅細(xì)胞溶血的影響

紅細(xì)胞是機(jī)體運輸O2和CO2的細(xì)胞，含有引發(fā)催化脂質(zhì)過氧化作用的物質(zhì)血紅蛋白，膜上又含有大量不飽合脂肪酸，因此容易受到氧化損傷。本實驗用H2O2誘導(dǎo)紅細(xì)胞氧化溶

血來研究杜仲葉提取物對紅細(xì)胞膜氧化損傷的抑制作用。結(jié)果如表3所示。

表3結(jié)果顯示，正常的紅細(xì)胞在體外溫育過程中有輕微的溶血現(xiàn)象，這與報道結(jié)果一致[8]。模型組與正常組有極顯著差異，說明H2O2可以誘導(dǎo)紅細(xì)胞的氧化溶血；加藥組低于模型組，差異顯著或極顯著，且呈一定的量效關(guān)系，說明杜仲葉提取物可以抑制紅細(xì)胞的氧化溶血。

2．4 杜仲葉提取物對小鼠心、肝勻漿及肝線粒體脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物生成的影響

MDA為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，它可與含有游離氨基的蛋白質(zhì)、磷脂酰乙醇胺及核酸等進(jìn)行多次交聯(lián)，連接成比原來大許多倍的大分子，致使膜蛋白變性，膜酶失活，膜受體失效，出現(xiàn)膜結(jié)構(gòu)的破壞，膜流動性下降，膜脆性和通透性的增加，導(dǎo)致生物膜結(jié)構(gòu)和功能的異常，影響機(jī)體的物質(zhì)代謝，能量代謝和信息傳遞，從而危及正常的生命活動。其生成的多少可以反映出組織細(xì)胞的受損程度。在生物體內(nèi)90％以上的氧分子在線粒體中被消耗，氧作為呼吸鏈的終電子受體參與產(chǎn)生ATP的氧化磷酸化反應(yīng)，是維持生命的重要能量代謝過程，但是氧通過一系列化學(xué)反應(yīng)生成有害的氧自由基，造成細(xì)胞損傷并導(dǎo)致疾病和衰老。實驗證明線粒

體是細(xì)胞中產(chǎn)生活性氧的一個重要部位，CHANCE等[9] 證明在正常生理情況下約有2％的氧消耗于線粒體活性氧的產(chǎn)生，生成活性氧的前體是02和H2O2，它們是呼吸鏈底物端漏出的電子引起氧分子單電子還原生成的。本實驗用FeSO4和H2O2產(chǎn)生·OH來誘導(dǎo)組織脂質(zhì)過氧化，測定了杜仲葉提取物對小鼠心、肝勻漿及肝線粒體中MDA生成的影響，結(jié)果如表4、表5、表6所示。

表4、表5、表6顯示，模型組與正常組相比，MDA的生成量增加，數(shù)據(jù)差異極顯著，說明·OH可使小鼠心臟、肝臟及肝線粒體的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)加速。加藥組與模型組相比MDA的含量顯著下降，數(shù)據(jù)差異顯著或極顯著，說明杜仲葉提取物可以有效抑制·OH所致的小鼠組織及肝亞細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的發(fā)生，保護(hù)細(xì)胞膜的完整性，從而保護(hù)組織免受損傷，而且抑制率隨杜仲葉提取物濃度增加而提高。

[參考文獻(xiàn)]

[1]王景祥．杜仲葉與杜仲皮的成分比較中草藥EJ]．1987，18(3)：11．

[2]張康健．杜仲葉與皮有效成分含量的比較研究[J]．西北林學(xué)院學(xué)報，1996，11(2)：42．

[3]宋麗青．杜仲葉與杜仲皮的藥理試驗[J]．中草藥，1986，17(2)：15．

[4]王書芳，王勤，潘靜，等．吡咯啉氮氧自由基及衍生物抗大鼠不同組織脂質(zhì)過氧化損傷[J]．中國藥理學(xué)通報，2001，17(4)：424—427．

[5]王建華，張民，甘璐，等．枸杞多糖一1對羥自由基所致小鼠肝線粒體損傷的作用[J]．中國藥學(xué)雜志，2001，36(10)：669．

[6]田京偉，楊建雄．白藜蘆醇苷的體外抗氧化活性[J]．中草藥，2001，32(10)：918—920．

[7]曹煒，尉亞輝，楊建雄．蜂膠對氧自由基和四氧嘧啶致小鼠肝臟損傷的保護(hù)作用[J]．中草藥，2001，32(11)：1013—1015．

[8]馮立明，潘華珍，閔福寶，等．麥芽醇對紅細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用[J]．中國藥理學(xué)通報，1990，11(6)：26．

[9]CHANCE B，SIES H，BOVERIS A．Hydropemxide metabolism in mammalian organs[J]．Physiological Reviews，1979，59(3)：527—605．