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黃麗霞，賈曉斌，陳彥，趙呈雷，封亮，蔡垠(1.江蘇省中醫(yī)藥研究院，

南京市210028；2.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，鎮(zhèn)江市212013)

摘要 目的:建立以高效液相色譜法測定夏枯草中熊果酸含量的方法，并檢測不同產(chǎn)地夏枯草中熊果酸的含量。方法:色譜柱為ZorbaxSBC18(150mm×4.6mm，5μm)，流動相為乙腈-磷酸鹽緩沖液(pH7.6)=45∶55，檢測波長為210nm，流速為1.0mL·min-1。結(jié)果:熊果酸進(jìn)樣量在0.1115~1.7840μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系(r=0.9992)；平均回收率為99.93%，RSD=0.77%(n=6)。不同產(chǎn)地夏枯草中熊果酸的含量在0.08%~0.18%之間。結(jié)論:不同產(chǎn)地夏枯草中熊果酸含量差異很大。本方法簡便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于夏枯草的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜法；夏枯草；熊果酸；含量測定；產(chǎn)地

夏枯草(SpicaPrunellae)為唇形科植物夏枯草PrunellavulgarisL.的干燥果穗，具有清火、明目、散結(jié)、消腫之功效[1]。其含有多種活性成分，主要有三萜類、甾體類、黃酮類、香豆素類等化合物�，F(xiàn)代臨床和藥理研究表明，夏枯草具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒等作用[2，3]，臨床可用于治療瘰疬、癭瘤、乳癰腫痛、甲狀腺腫大等癥。熊果酸是夏枯草中的有效成分，具有抗病毒性肝炎、抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗炎等多種生物活性[4]。夏枯草在全國各地均有生長，尤以江蘇、浙江、安徽、河南等地為主要產(chǎn)區(qū)，雖然個別地區(qū)有夏枯草GAP種植基地，但全國范圍內(nèi)仍以野生入藥為主。不同生長環(huán)境、不同加工方法可導(dǎo)致藥材的質(zhì)量存在差異。因此，筆者采用高效液相色譜(HPLC)法測定不同產(chǎn)地夏枯草中熊果酸的含量，為評價各地夏枯草藥材的質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1200型高效液相色譜儀，包括在線脫氣機(jī)、四元梯度泵、自動進(jìn)樣器、恒溫柱溫箱、DAD檢測器(美國Agilent公司)；1200型化學(xué)工作站(美國Agilent公司)；十萬分之一電子天平(瑞士MettlerToledo公司)；索氏提取器(四川蜀玻(集團(tuán))有限責(zé)任公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)。熊果酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:110742-200516)；乙腈(色譜純，美國Tedia公司)；水為純凈水，乙醚、石油醚、磷酸二氫鉀等均為分析純；夏枯草藥材購自江蘇、貴州、廣西、安徽、湖南等地，均為2007年產(chǎn)，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室吳德康教授鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:ZorbaxSBC18 (150mm×4.6mm，5μm)；流動相:乙腈-磷酸鹽緩沖液(pH7.6)=45∶55；流速:1.0mL·min-1；檢測波長:210nm；柱溫:30℃。在此條件下，熊果酸與其相鄰成分分離度較好(R>1.7)。色譜見圖1。

2.2 對照品貯備液的制備

精密稱取熊果酸對照品4.46mg，置于20mL量瓶中，用無水乙醇溶解并定容，配制成0.223mg·mL-1的對照品貯備液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取不同產(chǎn)地的夏枯草粗粉，置于索氏提取器中，加適量乙醚浸泡過夜，加熱回流6h，回收溶劑，殘?jiān)�用石油�?60~90℃)浸泡2次，每次15mL，浸泡2min，傾出石油醚液，殘?jiān)鼡]干溶劑，用無水乙醇溶解并轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，加無水乙醇至刻度，精密量取1mL至10mL量瓶中，以無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，0.45μm微孔濾膜過濾，即得不同產(chǎn)地的夏枯草供試品溶液。

2.4 陰性對照溶液的制備

取適量乙醚置于索氏提取器中，按“2.3”項(xiàng)下方法自“加熱回流6h”起制備陰性對

照溶液。

2.5 線性關(guān)系考察

取上述對照品貯備液，分別吸取0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL，置于10mL量瓶中，以無水乙醇定容至刻度，得不同濃度的對照品溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣20μL，測

得峰面積積分值。以對照品的進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=13077X—8.8793(r=0.9992)。結(jié)果表明，熊果酸進(jìn)樣量在0.1115~1.7840μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下同一熊果酸對照品，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。結(jié)果，RSD=0.39%，表明儀器精密度良好。

2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一產(chǎn)地(貴州)藥材，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果，RSD=1.09%，表明方法重現(xiàn)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，在0、2、4、8、12、24h時間點(diǎn)分別進(jìn)樣分析。結(jié)果，熊果酸峰面積基本不變，RSD=1.26%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的同一產(chǎn)地(貴州)樣品約1g，共6份，分別精密加入相應(yīng)含量的熊果酸對照品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.10 樣品含量測定

取10個產(chǎn)地的夏枯草藥材，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算含量，結(jié)果詳見表2。

3 討論

由表2可知，不同產(chǎn)地夏枯草藥材中熊果酸含量的差異很大。在所測的10個產(chǎn)地的藥材中，以四川產(chǎn)夏枯草中含量最高，江蘇盱眙產(chǎn)夏枯草中含量最低。故臨床在應(yīng)用時應(yīng)嚴(yán)格控制藥材的質(zhì)量，以確保藥效。

熊果酸為五環(huán)三萜類成分，分子中僅存在一個雙鍵，其無水乙醇溶液在205nm波長處有最大吸收，但在此波長下，甲醇末端吸收較嚴(yán)重，基線不夠理想，故選擇檢測波長為210nm。筆者通過查閱文獻(xiàn)[5，6]，經(jīng)預(yù)試驗(yàn)比較后，最終采用乙腈-磷酸鹽緩沖液(pH7.6)=45∶55為流動相，既可較好地測定熊果酸含量，又能使其與相鄰成分達(dá)到基線分離。本方法簡便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可更好地用于夏枯草的質(zhì)量控制。

參考文獻(xiàn)

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