可見(jiàn)分光光度法測(cè)定杜仲葉中的綠原酸 | 可見(jiàn)分光光度法測(cè)定杜仲葉中的綠原酸 |
| 發(fā)布時(shí)間:2010-10-20 信息來(lái)源:admin 發(fā)布人:admin 點(diǎn)擊次數(shù):3960 |
袁華，鄧良，孫炎彬，楊小俊，閆志國(guó)，吳元欣+ (武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，武漢430073) 摘要：研究杜仲葉中綠原酸含量的檢測(cè)方法。利用綠原酸和鋁離子的絡(luò)合顯色反應(yīng)，采用可見(jiàn)分光光度法在波長(zhǎng)530 nm處測(cè)定杜仲葉中綠原酸量。綠原酸質(zhì)量濃度在1．7×10-4～一1．O×10-2～g·L-1。1之間線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)為0．9995。秋、夏葉中加標(biāo)回收率分別為98．0％，101．0％。該方法簡(jiǎn)便、實(shí)用、準(zhǔn)確。 關(guān)鍵詞：杜仲葉；綠原酸；可見(jiàn)分光光度法 杜仲(Eucommia Ulmoides 0liv．)是我國(guó)特有的經(jīng)濟(jì)樹(shù)種，其藥用價(jià)值歷來(lái)受到人們關(guān)注，2000多年前的《神農(nóng)本草經(jīng)》就將之列為中藥上品，杜仲具有降血壓、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、抗衰老、抗腫瘤等功效。近來(lái)的研究證實(shí)杜仲葉與皮的化學(xué)成分基本一致，其中綠原酸(Chlorogenic acid)是杜仲起藥理作用的主要有效成分之一[1-2]。因此，和金銀花、杜仲皮等原料比較，從廉價(jià)的杜仲葉中提取綠原酸是一種更為經(jīng)濟(jì)合理的工藝方法。綠原酸的分析檢測(cè)方法包括薄層掃描法、導(dǎo)數(shù)極譜法、紫外分光光度法、化學(xué)發(fā)光分析法、氣相色譜法、高效液相色譜法等多種分析方法[3-6]�，F(xiàn)有的綠原酸定量分析大多需要專(zhuān)門(mén)的分析儀器設(shè)備，對(duì)于實(shí)驗(yàn)室一般經(jīng)常性分析來(lái)說(shuō)，費(fèi)用過(guò)高而且不及時(shí)，因此非常有必要尋找一種依靠簡(jiǎn)單儀器和適合基層操作的快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)分析方法。 本文在前人工作的基礎(chǔ)上，利用綠原酸和鋁離子的絡(luò)合顯色反應(yīng)，采用可見(jiàn)分光光度法測(cè)定杜仲葉中的綠原酸。該方法儀器簡(jiǎn)單、方法簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確，滿足了實(shí)驗(yàn)室和生產(chǎn)常規(guī)分析檢測(cè)的需要。 1材料與方法 1．1 測(cè)定原理 根據(jù)綠原酸類(lèi)物質(zhì)在堿性條件下與鋁離子形成穩(wěn)定的紫紅色絡(luò)合物，并產(chǎn)生特征吸收光譜而進(jìn)行測(cè)定。反應(yīng)式如圖1所示。
1．2主要儀器和試劑 1．2．1 主要儀器 721型分光光度計(jì)(上海分析儀器三廠)； 紫外分析儀(上海顧村電光儀器廠)。 1．2．2主要試劑及標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 硝酸鋁、亞硝酸鈉、乙醇、氫氧化鈉均為分析純。 杜仲葉采自湖北五峰縣。 綠原酸標(biāo)樣(中國(guó)藥品生物制品檢定所)。 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：用分析天平準(zhǔn)確稱(chēng)取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品0.0100 g，用95％乙醇溶解于500 mL的容量瓶中并定容，配制2×10-2g·L-1的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。 1．3綠原酸溶液吸光度測(cè)定 取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液～定體積于10 mL容量瓶中，加入0.5 mL 5％的NaN0，和0．5 mL 10％的Al(N03)3靜置5 min，再加人2 mL 1 mol·L-1的NaoH溶液并用體積分?jǐn)?shù)95％乙醇定容，以95％乙醇作空白溶液，在530 nm處測(cè)定吸光度A。 1．4杜仲葉預(yù)處理及綠原酸量測(cè)定 準(zhǔn)確稱(chēng)取10．0 g杜仲葉，用40％乙醇溶液按料液比為1：14，在80℃下回流提取150 min，重復(fù)提取3次。通過(guò)薄層色譜分析，在紫外分析儀下觀察熒光現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)第3次提取液中顯示綠原酸的藍(lán)色熒光非常暗淡，說(shuō)明從杜仲葉中第3次提取的綠原酸含量非常低。因此合并第1次和第2次提取液，將提取液濃縮定容于200 mL容量瓶中。吸取100 uL提取液，點(diǎn)樣于20 cm×10 cm硅膠G薄層板上成2 cm均勻帶狀，用v(乙酸乙酯)：v(甲醇)：v(水)=10：4：3作展開(kāi)劑，按常規(guī)操作展開(kāi)。風(fēng)干薄板，劃出與標(biāo)準(zhǔn)品相同位置展開(kāi)點(diǎn)的譜帶，刮下吸收帶部分的硅膠置于50 mL錐形瓶中，用10 mL體積分?jǐn)?shù)80％乙醇溶液洗脫30min，將洗脫液定容至20 mL，分別量取綠原酸樣品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL于10 mL容量瓶中定容，按1．3方法顯色并測(cè)量吸光度A，計(jì)算杜仲葉樣品中綠原酸的含量。 2結(jié)果與討論 2.1 絡(luò)合物顯色的吸收光譜 配制一定濃度的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1．3實(shí)驗(yàn)方法操作，吸光度A結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，吸收峰在530 nm處最大，因此選用530 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。
2.2綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確吸取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1．0，2．0，3．0，4．0，5．0 mL，分別按1．3方法顯色并定容至10 mL，在530 nm處測(cè)量吸光度。將吸光度4值對(duì)綠原酸的質(zhì)量濃度c值進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A=0．000 392 C一0．006 7，r=0．999 5，綠原酸質(zhì)量濃度在1.7×10-4～1.0×10-2g·L一之問(wèn)線性關(guān)系良好，結(jié)果如圖3所示。 2．3顯色溶劑的選擇 實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)綠原酸溶液用量、顯色劑用量和操作條件都相同時(shí)，分別用蒸餾水和95％乙醇做顯色溶劑，兩種顯色溶液的初始吸光度無(wú)大的差別。但是用95％乙醇顯色的溶液，其吸光度能夠保持更長(zhǎng)的時(shí)間不變化，說(shuō)明乙醇對(duì)顯色化合物具有穩(wěn)定作用，顯色化合物的吸光度在1 h內(nèi)無(wú)變化，完全能夠滿足測(cè)定的要求。
2．4絡(luò)合顯色劑用量的確定 綠原酸質(zhì)量濃度在1．0×10-2g·L-1以內(nèi)時(shí)，向溶液中加入5％的NaNO2和10％的A1(NO3)3溶液各0.5mL，溶液中的綠原酸可完全形成穩(wěn)定的紫紅色絡(luò)合物。A13+為配合物的中心離子，AJ(No3)3的適宜加入量為0．5 mL，較少時(shí)吸光度偏低，較多時(shí)則影響不大。NaN02用作還原劑，以防止綠原酸被氧化。 2．5絡(luò)合顯色時(shí)間的選擇 隨著溫度升高，顯色時(shí)間明顯縮短。在25℃，35℃，50℃的水浴中，絡(luò)合顯色反應(yīng)達(dá)到穩(wěn)定的時(shí)間分別為5，3，1 min。由于顯色反應(yīng)在室溫下就能在較短的時(shí)間內(nèi)完成，故選擇室溫下顯色5 min。 2．6薄層層析展開(kāi)劑的選擇 對(duì)杜仲葉提取液的薄層分離展開(kāi)劑進(jìn)行了不同組成和配比的對(duì)比實(shí)驗(yàn)分析，其中以v(乙酸乙酯)：v(甲醇)：v(水)=10：4：3分離效果最好，可使綠原酸與干擾物質(zhì)完全分離，Rf值0.65，薄層層析示意圖如圖4所示。
2．7精確度與回收率 取夏天和秋天采摘的杜仲葉各10.0 g，按1.4實(shí)驗(yàn)方法操作，測(cè)定杜仲葉中綠原酸的量，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。量取濃縮后的杜仲葉樣品溶液5．0 mL，加入一定量的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品，定容于10mL容量瓶中。吸取100仙L提取液，點(diǎn)樣于薄板上成均勻帶狀，按常規(guī)操作展開(kāi)。風(fēng)干薄板，刮下吸收帶部分的硅膠，用10 mL體積分?jǐn)?shù)80％乙醇溶液洗脫30 min，將洗脫液定容至20 mL，分別量取溶液1.0，2.0，3.0mL于10 mL容量瓶中定容，按1．3方法顯色并測(cè)量吸光度A，計(jì)算加標(biāo)后樣品中綠原酸的量以及加標(biāo)回收率。
3 結(jié)論 綠原酸在堿性條件下可與鋁離子形成穩(wěn)定的紫紅色絡(luò)合物，并產(chǎn)生特征吸收光譜。采用721型可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)杜仲葉中的綠原酸質(zhì)量濃度進(jìn)行分析測(cè)定，儀器簡(jiǎn)單、方法實(shí)用、結(jié)果準(zhǔn)確。實(shí)驗(yàn)確定顯色化合物最大吸收波長(zhǎng)為530 nm，綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為4=0.000 392 c—0.006 7(r=0．999 5)，綠原酸質(zhì)量濃度在1．7×10-4g·L-1～1．0×10-2g·L-1之間線性關(guān)系良好。 參考文獻(xiàn)： [1] 趙玉英，耿權(quán)，程鐵民．杜仲化學(xué)成分研究概況[J]．天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，1995，7(5)：46—52． [2] 曲保雪，朱立紅，蘆春蓮．杜仲產(chǎn)品加工利用現(xiàn)狀與進(jìn)展[J]，河北林果研究，2001，16(4)：387-391． [3] 王麗，帥琴，湯志勇，等．茶葉樣品中綠原酸含量的高效液相色譜測(cè)定[J]．分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2001，20(1)：76-78． [4] 聶麗萍，左興華．薄層掃描法測(cè)定清熱顆粒中綠原酸的含量[J]．河北中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2002，17(3)：27-28． [5]李自林，鄭筱梅，王琰．綠原酸的導(dǎo)數(shù)極譜法測(cè)定[J]．化學(xué)研究與應(yīng)用，1998，18(1)：199—202． [6]劉圣金，狄留慶，吳德康，等，高效液相色譜法測(cè)定杜仲中綠原酸的含量[J]．中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2006，13(1)：44_45． 產(chǎn)品鏈接： 杜仲提取物 綠原酸 金銀花提取物 苦杏仁苷 枇杷葉提取物-熊果酸 大花紫薇提取物-科羅索酸 上禾生物 專(zhuān)注植提 精于高純 基于您對(duì)天然產(chǎn)物需求持續(xù)創(chuàng)新 |
