環(huán)糊精鍵合凝膠介質(zhì)分離純化金銀花中綠原酸 | 環(huán)糊精鍵合凝膠介質(zhì)分離純化金銀花中綠原酸 |
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張毅敏， 譚天偉 (北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100029) 摘 要：采用寡聚環(huán)糊精鍵合凝膠柱分離純化金銀花中的綠原酸，考察了流動(dòng)相、柱溫、負(fù)載量及介質(zhì)再生等因素對(duì)分離純化效果的影響. 分別用脲和十二烷基磺酸鈉掩蓋氫鍵和疏水作用，探討了分離機(jī)理. 結(jié)果表明，以水:乙醇:醋酸體積比為85:10:5 的混合溶液，負(fù)載量為0.5 mg/mL 進(jìn)行等度洗脫，常溫下通過(guò)一次色譜即可分離純化綠原酸，其收率和純度分別達(dá)到65%和97%以上. 介質(zhì)使用10 次后需要再生，先后經(jīng)0.3 mol/L NaOH、水和30%乙酸簡(jiǎn)單再生即可重復(fù)利用. 關(guān)鍵詞：環(huán)糊精；金銀花提取物；綠原酸；分離純化 1 前言 金銀花為忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thunb.)、紅腺忍冬(Lonicera hypoglauca Miq.)或山銀花(Lonicera dasystyla confusa DC.)的干燥花蕾或初開(kāi)的花，其含有的藥物有效成分主要為綠原酸類化合物，另外還含有黃酮類、三萜皂苷類和揮發(fā)油等[1−3]. 金銀花的綠原酸提取物具有清熱解毒、散風(fēng)消腫的功能，用于治療外感風(fēng)熱、流行性感冒、癤瘡?fù)茨[諸病[4,5]. 綠原酸可以作為粉針、針劑、注射劑的醫(yī)藥原料[6]. 綠原酸(Chlorogenic Acid, CHA) 是由咖啡酸(Caffeic acid)與奎尼酸(Quinic acid)生成的縮酚酯，為苯丙素類化合物. 目前從植物中發(fā)現(xiàn)的綠原酸異構(gòu)體有7 種，其中綠原酸和異綠原酸(Isochlorogenic Acid, ICHA) C 含量較高[7]. 綠原酸是眾多抗菌解毒、消炎利膽藥材的主要有效成分，常被用作藥物定性或定量指標(biāo)[8]. 綠原酸和異綠原酸C 的分子結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1.
目前常見(jiàn)的綠原酸精制方法主要是柱層析法. 高春榮等[9]采用D101 型大孔樹(shù)脂分離純化了金銀花中的綠原酸，所得綠原酸純度和提取率分別為85%和65.12%，大孔吸附樹(shù)脂對(duì)綠原酸的吸附率相對(duì)偏低. 徐濤等[10]將金銀花水提物通過(guò)親脂性吸附樹(shù)脂和葡聚糖凝膠Sephadex LH-20 進(jìn)行分離純化，所得綠原酸純度大于98%. 該方法操作繁瑣，純化時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)設(shè)備要求較高. 以交聯(lián)瓊脂糖凝膠為基體、β-環(huán)糊精(β-CD)為配基的新型環(huán)糊精鍵合相具有特異性吸附的顯著優(yōu)點(diǎn)，特別適用于分離中藥有效成分. 葛根黃酮中的葛根素[11,12]、茶多酚中的表沒(méi)食子兒茶素[13]、銀杏黃酮水解液中的槲皮素、山奈酚和異鼠李素[14]、丹參中的丹參素[15]、虎杖中的虎杖苷和白藜蘆醇[16]等均可采用該方法得到有效純化，但還未見(jiàn)采用該方法對(duì)苯丙素類物質(zhì)進(jìn)行純化的報(bào)道. 本研究提出了采用寡聚環(huán)糊精鍵合凝膠介質(zhì)一步純化金銀花中綠原酸的新方法，考察了流動(dòng)相和柱溫等分離條件，研究了色譜柱的負(fù)載量和再生條件，并探討了色譜分離過(guò)程中的作用機(jī)理. 2 實(shí)驗(yàn) 2.1 材料和儀器 乙醇、甲醇、醋酸、氫氧化鈉、硝酸銨、磷酸、脲(Urea)、十二烷基磺酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfonate, SDS)均為分析純(北京化工廠)，綠原酸粗品(金銀花、杜仲、紫錐菊)購(gòu)于湖南長(zhǎng)沙九匯現(xiàn)代中藥有限公司，綠原酸對(duì)照品(純度>98%)購(gòu)于中國(guó)生物制品藥品檢驗(yàn)所.色譜填充柱β-CD 低聚物偶聯(lián)Sepharose HP(瑞典Uppsala 大學(xué)Janson 教授提供)，恒流泵LP-20C(衛(wèi)星制造廠北京星達(dá)公司)，8823A 紫外檢測(cè)器(北京新技術(shù)應(yīng)用研究所)，N2000 色譜工作站(浙江大學(xué))，七通進(jìn)樣閥(瑞典Uppsala 惠贈(zèng))，島津10A VP 高效液相色譜(日本島津公司)，Quattro Premier XE 串聯(lián)四級(jí)桿電噴霧質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters 公司). 2.2 實(shí)驗(yàn)方法 2.2.1 分離介質(zhì)的制備方法 β-CD 鍵合固定相制備方法如下[17]：第一步為凝膠的活化. 先用蒸餾水洗滌Sepharose HP，然后將蒸餾水、Sepharose HP 和50% NaOH 溶液加入反應(yīng)瓶控溫?cái)嚢?向反應(yīng)瓶中緩慢流加環(huán)氧氯丙烷，并加入醋酸調(diào)節(jié)pH，最后用蒸餾水洗滌凝膠，即可得到經(jīng)環(huán)氧氯丙烷活化的Sepharose HP；第二步為偶聯(lián)β-CD. 將蒸餾水、已活化的凝膠、β-CD、50% NaOH 和NaBH4 加入反應(yīng)瓶中控溫?cái)嚢柽M(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，并用醋酸調(diào)節(jié)pH. 反應(yīng)結(jié)束后，用少量蒸餾水洗滌除去不溶反應(yīng)物，即得到β-CD 低聚物偶聯(lián)Sepharose HP. 2.2.2 制備色譜樣品的準(zhǔn)備 將50 mg 綠原酸粗品溶解于5 mL 流動(dòng)相中配制成10 mg/mL 的溶液，用0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾并將澄清溶液通過(guò)七通閥進(jìn)樣. 2.2.3 樣品分離純化 在等梯度吸附色譜模式下從綠原酸粗品中分離純化綠原酸，通過(guò)改變流動(dòng)相組成和配比，確定制備色譜分離流動(dòng)相，流動(dòng)相流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為1 mL.紫外檢測(cè)吸收波長(zhǎng)為280 nm ， 色譜固定相為Oligo-β-cyclodextrin coupled Sepharose HP，柱管為玻璃材質(zhì)，柱體積22 mL. 2.2.4 綠原酸的分離度、收率和純化倍數(shù)計(jì)算方法 分離效果以分離度R 表示. 分離度是衡量混合物兩組分在色譜柱中分離效果的指標(biāo)，計(jì)算公式如下： R=2(t2−t1)/(W1+W2), (1) 式中，t1, t2 為組分1 和組分2 的保留時(shí)間(min), W1, W2為組分1 和組分2 的色譜峰兩邊轉(zhuǎn)折點(diǎn)所劃切線與基線相交點(diǎn)之間的截距. 綠原酸粗提物溶液上樣后，用流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，收集的綠原酸洗脫液經(jīng)真空濃縮和真空干燥得到純化的綠原酸產(chǎn)品，產(chǎn)品中綠原酸的百分含量即為其純度，綠原酸收率Y 和純化倍數(shù)T 的計(jì)算公式如下： Y(%)=C1M1/(C0M0)×100%, (2) T=C1/C0, (3) 式中，C1 為純化后產(chǎn)品中綠原酸含量(mg/mg)，M1 為純化后綠原酸產(chǎn)品質(zhì)量(mg)，C0 為純化前綠原酸粗提物中綠原酸含量(mg/mg)，M0 為綠原酸粗提物質(zhì)量(mg). 2.2.5 高效液相色譜分析方法 流動(dòng)相為含1%磷酸的乙腈水溶液(乙腈:水體積比10:90)，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣體積20 μL，紫外檢測(cè)吸收波長(zhǎng)325 nm，色譜柱為Kromasil C18 柱(150 mm×3.9mm, 5 μm). 3 結(jié)果與討論 3.1 流動(dòng)相對(duì)分離效果的影響 綠原酸是由咖啡酸與奎尼酸形成的酯，其分子結(jié)構(gòu)中含有酯鍵、不飽和雙鍵及多元酚3 種不同官能團(tuán)[18]，研究中首先選擇乙酸−水和乙醇−水2 種不同體系考察流動(dòng)相對(duì)分離效果的影響. 由研究結(jié)果可知，使用5%~40%(ϕ)的乙酸水溶液對(duì)綠原酸沒(méi)有明顯的分離效果. 乙醇−水體系乙醇為10%(ϕ)時(shí)就能將綠原酸和其他組分分離，隨乙醇濃度增加，綠原酸保留時(shí)間縮短，同時(shí)峰展寬縮小，但當(dāng)乙醇增加到30%(ϕ)時(shí)，綠原酸和前一個(gè)雜質(zhì)峰的分離度迅速下降到0.4. 因此，流動(dòng)相中的乙醇濃度應(yīng)維持在相對(duì)較低的水平. 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，乙醇−水體系中加少量乙酸可達(dá)到兼顧分離度和保留時(shí)間的目的. 選擇不同體積比的水−乙醇−乙酸混合溶液為流動(dòng)相，分段收集綠原酸流出液.圖2 為乙醇:乙酸:水體積比為10:5:85 的三相體系為流動(dòng)相的綠原酸的色譜分離圖，圖中標(biāo)示的主吸收峰為綠原酸.
3.2 柱溫對(duì)分離效果的影響 在0.5 mg/mL(濕凝膠，下同)的負(fù)載量下，分別在不同溫度下進(jìn)行色譜分離，考察溫度與綠原酸保留時(shí)間的關(guān)系，結(jié)果如表1 所示. 在10~35℃溫度下保留時(shí)間變化不大. 10 ℃時(shí)進(jìn)行色譜分離，綠原酸的分離度為1.011，分離效果最好. 隨溫度升高，分離度下降，35℃ 時(shí)綠原酸的分離度降低到0.588. 這是由于在綠原酸的分離過(guò)程中，分子間氫鍵是比較主要的
作用力. 氫鍵對(duì)溫度敏感，所以溫度改變對(duì)綠原酸分離度影響很大. 3.3 柱負(fù)載量的測(cè)定 取進(jìn)樣量為1~50 mg，對(duì)不同的進(jìn)樣量分別計(jì)算目標(biāo)產(chǎn)品綠原酸和相鄰前一雜質(zhì)的分離度(綠原酸與相鄰后一雜質(zhì)均為基線分離，故不予考慮)，結(jié)果如圖3 所示. 從圖可以看出，在0.5 mg/mL 的高負(fù)載量時(shí)，綠原酸的分離度在0.50 左右，純度保持在80%左右. 3.4 綠原酸樣品的質(zhì)譜鑒定 對(duì)制備的綠原酸樣品進(jìn)行質(zhì)譜鑒定和分析，方法見(jiàn)文獻(xiàn)[19]. 收集制備的綠原酸樣品在Waters Quattro Premier XE 串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀上進(jìn)行電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS/MS)鑒定，結(jié)果如圖4 所示，其中峰353.1 為綠原酸的分子離子峰，峰375.2 為結(jié)合了一分子鈉的綠原酸的負(fù)離子的質(zhì)譜峰. 與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照發(fā)現(xiàn)，所制樣品同標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜較一致，表明所制樣品為綠原酸，且雜質(zhì)很少. 通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)可知，金銀花的綠原酸提取物經(jīng)寡聚環(huán)糊精鍵合的凝膠介質(zhì)純化后，各種成分得到了有效分離，可以制得高純度綠原酸. 圖5 是綠原酸在質(zhì)譜中被轟擊后的裂解過(guò)程示意圖. 綠原酸受到轟擊后，裂解成為咖啡酸的正離子狀態(tài)和奎尼酸的負(fù)離子狀態(tài). 裂解過(guò)程有2 個(gè)途徑，一個(gè)是綠原酸的負(fù)離子直接裂解為咖啡酸的正離子狀態(tài)和奎尼酸的負(fù)離子狀態(tài)，另一個(gè)是結(jié)合了1 分子鈉的綠原酸的負(fù)離子裂解為咖啡酸和奎尼酸.
3.5 綠原酸收率和純度的關(guān)系 在0.5 mg/mL 的負(fù)載量下，分別采用不同體積比(80:20:0, 90:10:0, 85:10:5, 95:0:5, 90:0:10)的水−乙醇−乙酸三相體系作為流動(dòng)相，分段收集綠原酸流出液，采用HPLC 外標(biāo)法計(jì)算得到收集液中綠原酸的收率和純度，二者的關(guān)系如圖6 所示.
研究結(jié)果表明， 使用寡聚環(huán)糊精配基鍵合的Sepharose HP 介質(zhì)從金銀花的綠原酸提取物中精制綠原酸時(shí)，使用體積比為85:10:5 的水−乙醇−乙酸三相體系分離效果最好，僅經(jīng)過(guò)一次色譜分離，純度就能達(dá)到97%，此時(shí)的收率保持在65%以上，優(yōu)于大孔吸附樹(shù)脂法所得綠原酸(純度85%，收率65.12%). 與親脂性吸附樹(shù)脂和葡聚糖凝膠Sephadex LH-20 法比較，在綠原酸純度相同的情況下，本研究方法操作簡(jiǎn)單、收率較高. 3.6 寡聚環(huán)糊精鍵合凝膠柱的再生 經(jīng)過(guò)多次制備分離后，樣品中各組分在凝膠介質(zhì)上的分離度會(huì)明顯下降，如表2 所示. 色譜柱使用10 次后色譜分離度還保持在0.7 以上，綠原酸保持較好的分離效果，當(dāng)色譜柱使用11 次時(shí)，分離度降低到0.662，需要再生. 分別用丙酮、甲醇、乙醇、乙酸水溶液和NaOH水溶液對(duì)色譜柱進(jìn)行再生，結(jié)果表明單一的溶劑再生效果均不理想. 因此選擇多種溶劑對(duì)介質(zhì)進(jìn)行再生，發(fā)現(xiàn)先后用1 倍柱體積的0.3 mol/L NaOH、水和30%乙酸清洗后介質(zhì)即可再生. 再生后色譜柱對(duì)綠原酸的分離度達(dá)到1.208，分離效果很好.
3.7 金銀花、杜仲、紫錐菊中綠原酸的分離純化 為了考察本研究方法對(duì)不同藥材中綠原酸的分離效果，選取金銀花、杜仲、紫錐菊3 種藥材的綠原酸粗提物，分別進(jìn)行了綠原酸的分離純化，得到綠原酸的精制產(chǎn)品，結(jié)果如表3 所示. 由表可以看出，本研究方法得到的3 種藥材的綠原酸分離度均達(dá)到0.96 以上. 精制 后金銀花中綠原酸產(chǎn)品純度達(dá)97%，純化倍數(shù)達(dá)3.9，紫錐菊中綠原酸的純化倍數(shù)最高，達(dá)6.54，這可能與紫錐菊的粗提物本身綠原酸的含量很低有關(guān).
3.8 分離機(jī)理 綠原酸類物質(zhì)是由咖啡酸與奎尼酸形成的酯，其分子結(jié)構(gòu)中有疏水性的母核和親水性的側(cè)鏈基團(tuán)—羥基.綠原酸類化合物能與環(huán)糊精配基同時(shí)發(fā)生氫鍵作用和疏水作用，從而為色譜分離過(guò)程提供保留作用力[20]. 在優(yōu)化后的流動(dòng)相中添加脲和十二烷基磺酸鈉(SDS)，以分別掩蓋色譜分離過(guò)程中的氫鍵和疏水作用，進(jìn)而探討了綠原酸的分離機(jī)理，結(jié)果如圖7 所示. 由圖7(a)可見(jiàn)，在流動(dòng)相中添加10%脲后，綠原酸的保留時(shí)間由50 min 降為40 min，且前一雜質(zhì)的色譜峰消失，綠原酸和前一雜質(zhì)的分離度從1.208 下降到0，這表明氫鍵在綠原酸的分離過(guò)程中起了十分重要的作用，與溫度對(duì)綠原酸的分離影響一致. 由圖7(b)可以看出，添加2% SDS 后，綠原酸的保留時(shí)間同樣由50 min降為40 min，綠原酸和前一雜質(zhì)的分離度下降到0.40，這表明疏水作用同樣對(duì)綠原酸的分離純化有重要影響.
4 結(jié)論 寡聚環(huán)糊精鍵合凝膠柱能純化金銀花中的綠原酸，流動(dòng)相、柱溫、負(fù)載量及介質(zhì)再生等因素對(duì)分離純化效果有重要影響，本研究得到如下結(jié)論： (1) 采用寡聚環(huán)糊精配基鍵合的Sepharose HP 凝膠介質(zhì)可以從綠原酸粗品中分離純化綠原酸. 確定的最佳流動(dòng)相為乙醇−乙酸−水(體積比為10:5:85)三相體系. (2) 介質(zhì)的負(fù)載量為0.5 mg/mL 時(shí)，僅通過(guò)一次色譜分離純化，綠原酸的純度即可達(dá)97%，收率為65%. (3) 色譜柱使用10 次后需要再生，分別使用1 倍柱體積的0.3 mol/L NaOH 溶液、水、30%乙酸清洗即可使介質(zhì)再生，再生后色譜柱的分離能力可恢復(fù). (4) 通過(guò)研究證實(shí)了分離過(guò)程中氫鍵和疏水作用同時(shí)存在，且都對(duì)綠原酸的分離有影響. 參考文獻(xiàn)： [1] 常新全, 丁麗霞. 中藥活性成分分析手冊(cè) [M]. 北京：學(xué)苑出版社,2002. 1377−1392. [2] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和藥典(第一部) [M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社, 2005. 152−153. [3] 匡海學(xué). 中藥化學(xué) [M]. 北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社, 2003. 133−135. [4] 李玉賢，楊懷，武雪芬. 金銀花莖葉藥用價(jià)值概述 [J]. 河南中醫(yī)藥學(xué)刊, 2000, 15(3): 23−24. [5] 張鞍靈，馬瓊，王藍(lán). 綠原酸及其類似物與生物活性 [J]. 中草藥,2001, 32(2): 173−176. [6] Wen A, Delaquis P, Toivonen P. Antilisterial Activity of Selected Phenolic Acids [J]. Food Microbiol., 2003, 20(3): 305−311. [7] Sondheimer E. Chlorogenic Acids and Related Depsides [J]. Botany Review, 1964, 30(4): 667−712. [8] 陳迪華，常琦. 天然多酚成分研究進(jìn)展 [J]. 國(guó)外醫(yī)藥(植物藥分冊(cè)), 1997, 12(1): 9−14. [9] 譚天偉，賀湘凌，Jason J C. 利用β-環(huán)糊精鍵合固定相分離純化葛根素 [J]. 色譜, 2003, 21(6): 610−613. [9] 高春榮，胡錦蓉，孫君社，等. 金銀花中綠原酸的提取工藝 [J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2003, 8(4): 5−8. [10] 徐濤，潘見(jiàn). 金銀花中綠原酸的分離純化 [J]. 阜陽(yáng)師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2005, 22(1): 8−10. [11] He X L, Tan T W, Janson J C. Separation and Purification of Puerarin Using Cyclodextrin-coupled Agarose Gel Media [J]. J. Chromatogr. A,2004, 1022(1): 77−82 [12] Li Y, Tan T W. Enhancement of the Isolation Selectivity of Isoflavonoid Puerarin Using Oligo-β-cyclodextrin Coupled Polystyrene-based Media [J]. Biochem. Eng. J., 2008, 40(1):189−198. [13] Xu J, Zhang G F, Tan T W. One-step Purification of EGCG from Crude Green Tea Extracts by Isocratic Hydrogen Bond Adsorption Chromatography on β-Cyclodextrin Substituted Agarose Gel Media[J]. J. Chromatogr. B, 2005, 24(8): 323−326. [14] Gu M, Su Z G, Janson J C. The Separation of Polyphenols by Isocratic Hydrogen Bond Adsorption Chromatography on a Cross-linked 12% Agarose Gel [J]. Chromatographia, 2006, 64(9):247−253. [15] Xu J, Tan T W, Janson J C. One Step Simultaneous Purification of Three Water-soluble Constituents in Crude Extracts from Danshen by Adsorption Chromatography on Oligo-β-cyclodextrin Substituted Agarose Gel Media [J]. Process Biochem., 2006, 47(10): 77−81. [16] Gu M, Su Z G, Janson J C. One-step Purification of Resveratrol and Polydatin from Polygonum cuspidatum (Sieb. & Zucc.) by Isocratic Hydrogen Bond Adsorption Chromatography on Cross Linked 12% Agarose [J]. Chromatographia, 2006, 64(10): 701−704. [17] 鄧?yán)T天偉，Janson J C. β-環(huán)糊精鍵合固定相分離純化銀杏葉提取物和銀杏黃酮 [J]. 中草藥, 2004, 35(10): 1105−1106. [18] 烏蘭. 金銀花中綠原酸的提取及抗氧化性的研究 [D]. 天津：天津科技大學(xué). 2005. 12−14. [19] Hu F L, Deng C H, Zhang X M. Quantitative Determination of Chlorogenic Acid in Honeysuckle Using Microwave-assisted Extraction Followed by Nano-LC-ESI Mass Spectrometry [J]. Talanta,2009, 77(4): 1299−1303. [20] Xu J, Tan T W, Janson J C. Mixed-mode Retention Mechanism for (−)-Epigallocatechin Gallate on a 12% Cross-linked Agarose Gel Media [J]. J. Chromatogr. A, 2006, 1137(12): 49−55. 產(chǎn)品鏈接： 杜仲提取物 綠原酸 金銀花提取物 苦杏仁苷 枇杷葉提取物-熊果酸 大花紫薇提取物-科羅索酸 上禾生物 專注植提 精于高純 基于您對(duì)天然產(chǎn)物需求持續(xù)創(chuàng)新 |
