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蔣王林 1，2*，高玉白1，田京偉1，傅風(fēng)華1

（1 山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院 山東 煙臺(tái) 264003；

2 中國(guó)藥科大學(xué)，江蘇 南京 210009）

摘要 目的研究大黃素葡甲胺犬靜脈注射體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)特征。方法 beagle 犬6 只，4mg.kg-1

靜脈注射，取血，HPLC 測(cè)定血漿藥物濃度。結(jié)果 大黃素葡甲胺在犬血中符合二房室模型處置特征，T1/2α：5.3±2.9min；T1/2β：37.4±6.7min；k21：0.035±0.009min-1；k10：0.085±0.030min-1；k12：0.069±0.062min-1；VC：347.3±84.4mL.kg-1；AUC：0.147±0.024min.mg.mL-1；CL：27.8±4.5mg.(kg.min)-1。結(jié)論 大黃素葡甲胺靜脈注射在犬體內(nèi)半衰期短，具有消除快，無藥物蓄積的特點(diǎn)。

關(guān)鍵詞 大黃素葡甲胺藥動(dòng)學(xué) HPLC 二房室模型

大黃素具有抗炎作用，能顯著抑制乙酸所致的小鼠毛細(xì)血管通透性增加[1]；促進(jìn)豚鼠離體腸管收縮[2]；呈劑量依賴性加強(qiáng)豚鼠結(jié)腸帶平滑肌細(xì)胞電和收縮活動(dòng)，機(jī)制與抑制細(xì)胞膜KATP 等鉀通道的活性相關(guān)[3]；亦明顯抑制大鼠肝纖維化形成[4]。我們進(jìn)行藥理研究時(shí)發(fā)現(xiàn)大黃素 10mg.kg-1 靜脈注射給藥對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性腸粘連有較好的治療作用（另文發(fā)表），為此我們對(duì)大黃素靜脈注射在犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行了研究，為臨床用藥提供理論指導(dǎo)。

1 材料

1.1 藥物與試劑：大黃素葡甲胺凍干粉針（由山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心制劑室提供，批號(hào)：規(guī)格：50mg）；肝素鈉注射液（徐州萬邦生化制藥有限公司，批號(hào)：020419）；大黃素葡甲胺對(duì)照品（自制，純度達(dá)99.5%以上）；色譜純甲醇，高氯酸、乙酸乙酯為分析純，重蒸水（自制）

1.2 動(dòng)物：種屬：beagle 犬，性別和數(shù)量：6 只，♀♂各半。動(dòng)物年齡和體重：4 個(gè)月齡，6.5～8.0kg，動(dòng)物來源：中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：中科滬動(dòng)管第99-0011 號(hào)

1.3 儀器：HPLC 色譜儀（泵：TSP P2000；自動(dòng)進(jìn)樣器：TSP AS3000；檢測(cè)器：UV3000；工作站 OS/2 cHemstation；恒溫箱）；色譜柱：discovery C18 柱（25cm×4.6mm，粒徑：5μm）；低壓溶劑過濾器；冷凍離心機(jī)，，渦旋振搖器，電子秤

2 方法

2.1 色譜條件[5]：流動(dòng)相：甲醇：0.1%磷酸水溶液（ 85：15）；流速：1.0mL.min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；柱溫:40℃ ；采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量測(cè)定血漿大黃素葡甲胺濃度。

2.2 樣品處理方法：犬股靜脈抽取2.0mL 血，肝素抗凝，3000r*min-1 離心10min，取血漿0.40mL 于1.5mL eppendorf 管中，加入6％高氯酸0.20mL，閉塞，于振搖器上振搖1 分鐘，加入乙酸乙酯0.40mL，閉塞，于振搖器上振搖1 分鐘，10000r*min-1 離心10min，精密吸取乙酸乙酯層0.20mL 于1.5mL eppendorf 管中，于40℃ N2 吹干，精密吸取色譜醇甲醇0.60mL，振搖溶解轉(zhuǎn)移至1.5mL 的進(jìn)樣甁中，自動(dòng)進(jìn)樣，上HPLC，進(jìn)樣體積為20μL，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行色譜分析。

2.3 試驗(yàn)方案：取大黃素葡甲胺凍干粉針，NS 溶解，配制成4.0 mg/ml 的藥液，隨即取beagle 犬6 只，耳緣靜脈給藥，劑量：4.0 mg.kg-1（按對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性腸粘連具有治療作用的有效劑量 10mg.kg-1 制定的），給藥體積：1.0 ml/kg，10s 給完，于給藥2、10、20、30、40、50、60、75、90、120 分鐘后犬大腿靜脈抽血2 mL，肝素抗凝，隨即離心，3000 r*min-1 10min，取上清液0.40 mL，其余操作同2.2項(xiàng)下。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線：取空白犬血漿，使血漿中大黃素脯甲胺標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為0.13、0.26、0.65、1.30、3.25、6.5、16.25 μg.mL-1，分別取血漿樣品0.40 mL，按2.2 項(xiàng)下操作后進(jìn)行HPLC 測(cè)定，進(jìn)樣體積為20 μL，實(shí)際大黃素脯甲胺標(biāo)準(zhǔn)品的進(jìn)樣濃度為0.043、0.086、0.215、0.43、1.075、2.15、5.375 μg.mL-1,得到大黃素葡甲胺的面積（ Abb）。以Abb 值作為Y 軸，以血漿大黃素葡甲胺濃度（ Cbb）為x 軸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=87708*x+893（r=0.9996），結(jié)果表明血漿大黃素葡甲胺濃度0.043μg.mL-1~5.375μg.mL-1 線性關(guān)系良好。

2.5 回收率：取含大黃素脯甲胺對(duì)照品濃度分別為1.70μg.mL-1、0.85μg.mL-1、0.425μg.mL-1、0.213μg.mL-1 的犬血漿0.40 mL，每一濃度分別取6 個(gè)樣品于1.5mL eppendorf 管中，加入6％高氯酸0.20mL，閉塞，于振搖器上振搖1 分鐘，加入乙酸乙酯0.40mL，閉塞，于振搖器上振搖1 分鐘，10000r*min-1 離心10min，精密吸取乙酸乙酯層0.20mL 于1.5mL eppendorf 管中，于40℃ N2 吹干，精密吸取色譜醇甲醇0.60mL，振搖溶解轉(zhuǎn)移至1.5mL 的進(jìn)樣甁中，結(jié)果四種濃度梯度的大黃素脯甲胺回收率見表1。

2.6 日內(nèi)與日間精密度：含大黃素脯甲胺低、中、高濃度血漿0.086、1.075、5.375μg.mL-1，按2.2 項(xiàng)下操作后進(jìn)行HPLC 測(cè)定，在48h 內(nèi)測(cè)定6 組，結(jié)果48小時(shí)內(nèi)RSD 值為3.51%，2.45%，1.89% 。

2.7 穩(wěn)定性：按標(biāo)準(zhǔn)曲線配制方法配制含大黃素脯甲胺濃度為0.26μg.mL-1、3.25μg.mL-1、16.25 μg.mL-1血漿樣品，每個(gè)濃度5份，每隔5天按2.2項(xiàng)下操作后進(jìn)行HPLC 測(cè)定1份，考察樣品在-20℃冷凍放置條件下的穩(wěn)定性 。結(jié)果3種濃度的大黃素脯甲胺血漿樣品在2 0天的穩(wěn)定性較好，RSD 值為4.58%，4.29%，4.35.%。

2.8 檢測(cè)限：以信噪比（S/N）為3 時(shí)的大黃素脯甲胺對(duì)照品濃度為本HPLC 方法的檢測(cè)限，取空白犬血漿，使血漿中大黃素脯甲胺標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為0.02μg.mL-1、0.040μg.mL-1、0.080μg.mL-1，分別取 0.40 mL 血漿，按2.2 項(xiàng)下操作。結(jié)果本法的檢測(cè)限達(dá)0.013μg.mL-1。

2.9 專一性：由色譜圖1 可以看出，犬血漿內(nèi)源性物質(zhì)與大黃素脯甲胺能很好地分離，均已達(dá)到基線分離效果，含大黃素脯甲胺血漿，處理后加入大黃素脯甲胺對(duì)照品溶液，峰重疊，表明專一性良好，成為標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量分析犬血漿大黃素脯甲胺濃度的前提。

2.10 數(shù)據(jù)處理：應(yīng)用中國(guó)藥理學(xué)會(huì)委員會(huì)編制的3P97 藥動(dòng)學(xué)計(jì)算軟件進(jìn)行處理

大黃素脯甲胺血漿藥物濃度。

3 結(jié)果

3.1 各樣品色譜圖：見圖1。大黃素脯甲胺對(duì)照品色譜圖顯示大黃素脯甲胺對(duì)照品的色譜峰均一，定量99.5%，保留時(shí)間為10.101min，從犬的空白血漿色譜圖可以看出血漿雜質(zhì)出峰比較靠前，在大黃素脯甲胺保留時(shí)間前后，無明顯雜質(zhì)峰，犬含藥保留時(shí)間為10.228min，犬含藥血漿處理樣品加入黃素脯甲胺對(duì)照品保留時(shí)間為10.232min。

3.2 大黃素葡甲胺血藥濃度-時(shí)間曲線

Fig.1 HPLC chromatograms of meglumine emodin reference substance (A) ,blank

plasma(B), plasma with drug(C), and plasma with drug added reference substance(D)

6 只犬靜脈推注大黃素脯甲胺后，測(cè)得大黃素脯甲胺平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖2。

圖2 大黃素葡甲胺靜脈推注犬血藥濃度-時(shí)間曲線

Fig.2 The curve of plasma drug concentration and time afte iv meglumine emodin

3.3 大黃素葡甲胺藥物動(dòng)力學(xué)特性

大黃素脯甲胺靜脈推注在犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)過程符合二房室模型，其主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表2。

表 2 大黃素葡甲胺靜脈注射犬體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

Table 2.The pharmacokinetic parameters in dogs after venous injection meglumine emodin

parameter unit

結(jié)果表明大黃素脯甲胺在犬體內(nèi)半衰期短，大黃素脯甲胺靜脈推注具有消除快，無藥物蓄積的特點(diǎn)。

4 討論

孫陽等[6]研究了大黃素及其代謝產(chǎn)物在小鼠體內(nèi)排泄的定量分析，結(jié)果小鼠單劑量口服大黃素91 mg/kg，在0-48h 內(nèi)，使用750 型微量紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定尿及糞中總蒽醌排泄量為劑量的53%，其中在0-24 小時(shí)尿排泄量為劑量的30%。王新宏[7]等對(duì)大鼠灌胃給予大黃，結(jié)果測(cè)定了血漿中大黃五種蒽醌苷元蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量。龐志功[8]等研究了家兔灌胃給予大黃后，測(cè)定了家兔體內(nèi)大黃素、大黃酚，血樣前處理使用薄層板分離大黃素、大黃酚進(jìn)行熒光測(cè)定,以上研究均未對(duì)大黃素進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)研究。J.W.Liang 等[9]對(duì)大黃素靜脈給藥在家兔（n＝6）體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行了研究，結(jié)果靜脈給藥10mg.kg-1 后在家兔血中符合二房室模型處置特征，AUC：0.518±0.355min.mg·mL-1，CL：72.3±49.2mg·(kg.min) -1，T1/2α：6.85±1.96 min；T1/2β：227±246 min，血漿蛋白結(jié)合率高達(dá)99.6%。

本文首次對(duì)大黃素葡甲胺鹽在犬體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行了研究，結(jié)果犬靜脈推注4mg/kg 后在犬血中符合二房室模型處置特征，與J.W.Liang 等的研究結(jié)果基本相同。

該方法色譜行為、大黃素脯甲胺血樣日內(nèi)與日間差試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、精密度試驗(yàn)、大黃素脯甲胺血樣加樣回收試驗(yàn)均符合要求，該方法分析時(shí)間短，大黃素出峰時(shí)間短，無干擾峰的特點(diǎn)，適用于血樣中的大黃素的測(cè)定。

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