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梅小斌, 袁偉杰, 湛馮蘭, 吳灝, 張曉瑛, 崔若蘭

( 第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院腎內(nèi)科, 上海200433)

[ 摘要] 目的: 探討周期素激酶抑制劑p27 在大黃素抑制腎系膜細(xì)胞( mesangial cell, MC) 增生中的作用。方法: 蛋白印跡( western 雜交) 方法測(cè)定MC 裂解液p27 蛋白水平, [ 3 H] 胸腺嘧啶核苷( [ 3H] TdR) 測(cè)定MC 增生的情況, 觀察不同濃度大黃素( 50 mg/L、100 mg/L ) 對(duì)腫瘤壞死因子-α( tumor necrosis factor-α, TNF-α) 刺激的MC 中p27 水平及增生程度的影響。結(jié)果:TNF-α( 20 萬U/L) 使無血清培養(yǎng)24 h 的MC 中p27 水平降低, 同時(shí)使[ 3H] TdR 摻入增加; 大黃素提高TNF-α刺激的MC 中p27 水平, 同時(shí)使[ 3H] TdR 摻入減少。大黃素的上述作用隨劑量的增大而增強(qiáng)。結(jié)論: 大黃素可能通過提高p27 水平抑制TNF-α誘導(dǎo)的MC 增生。

[ 關(guān)鍵詞] 大黃素; 周期素激酶抑制劑; 腫瘤壞死因子-α; 系膜細(xì)胞

體內(nèi)外研究證實(shí)大黃素能有效抑制腎系膜細(xì)胞( mesangial cell, MC) 及成纖維細(xì)胞增生[ 1 ～4] , 細(xì)胞增生與否受細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白( cell cycle regulatory proteins, CCRPs) 控制[ 5 ] , 其中周期素激酶抑制劑p27 是一種十分重要的CCRPs, 我們[ 6 , 7 ] 及Shankland

等[ 8] 的研究證實(shí)p27 水平下降在MC 增生中起重要作用。目前有關(guān)p27 與大黃素抑制MC 增生關(guān)系的報(bào)道較少見, 故本研究旨在探討p27 在大黃素抑制腫瘤壞死因子-α( tumor necrosis factor-α, TNF-α) 誘導(dǎo)的MC 增生中的作用, 為防治系膜增生性腎炎提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1 . 1 細(xì)胞培養(yǎng)SD 大鼠MC 按諶貽璞等[ 9 ] 方法培養(yǎng)和鑒定, 該MC 星形, 抗desmin 和抗vimetin 染色陽性, 抗Ⅷ 因子染色陰性。SD 大鼠MC 培養(yǎng)于含10% 小牛血清的正常糖( 1 000 mg /L) DMEM( Gibco公司產(chǎn)品) 中, 常規(guī)置于37℃、5% CO2 培養(yǎng)箱中孵育, 每周傳代2 ～3 次。

1 . 2 實(shí)驗(yàn)分組104 MC 培養(yǎng)于96 孔板( 美國Costar 公司產(chǎn)品) 中, 進(jìn)入實(shí)驗(yàn)前行無血清正常糖培養(yǎng)24 h, 然后分別無血清正常糖( 正常對(duì)照組) , 或無血清正常糖+ TNF-α20 萬U/L( TNF-α組) , 或無血清正常糖+ TNF-α20 萬U/L + 大黃素50 mg /L( 50 mg /L 大黃素組) , 或無血清正常糖+ TNF-α20 萬U/L + 大黃素100 mg /L( 100 mg /L 大黃素組)培養(yǎng)24 h。TNF-α由第二軍醫(yī)大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)教研室饋贈(zèng); 大黃素由第二軍醫(yī)大學(xué)生藥學(xué)教研室陳萬生教授提純饋贈(zèng), 經(jīng)高壓液相檢測(cè)純度在90% 以上。

1 . 3 [ 3H] 胸腺嘧啶核苷摻入上述組別的MC 在培養(yǎng)的最后6 h 每孔加入1 μCi [ 3 H] 胸腺嘧啶核苷( [ 3H] TdR) 。胰酶消化后用自動(dòng)細(xì)胞收集器收集細(xì)胞于纖維濾紙上, 濾紙干燥后加入液閃液, 液閃計(jì)數(shù)。

1 . 4 蛋白印跡用蛋白印跡( western 雜交) 方法測(cè)定MC 裂解液p27 蛋白水平。三去污劑裂解緩沖液( 1% SDS、1% NP- 40、5% 去氧膽酸鈉等) 裂解上述組別的MC, 4 ℃, 14 000 r /min 離心, 改良Lowry 法測(cè)定上清液蛋白濃度; 調(diào)整每個(gè)樣本的蛋白濃度至80 μg /15 μl, 15% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺( SDS-PAGE) 凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上;小鼠p27 單克隆抗體( 1∶ 500 稀釋, Santa Cruz 公司) 雜交1 h, 洗膜后加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠多抗( 1∶ 500 稀釋, 華美生物用品公司) 雜交1 h; 洗膜后加ECL( 增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光) 試劑( 上海吉泰科技公司) , 然后將硝酸纖維素膜放入X 光片暗盒,壓片, 顯影, 定影。利用圖象分析系統(tǒng)( 上海復(fù)日科技有限公司) 掃描確定X 光片上雜交條帶的相對(duì)光

密度值( 無血清正常糖培養(yǎng)24 h 的MC 中p27 光密度值為相對(duì)值1) 。

1 . 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均用x ±s 表示, 組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2 . 1 大黃素對(duì)TNF-α刺激的MC [ 3H] TdR 摻入的影響TNF-α使無血清培養(yǎng)24 h MC 中[ 3H] TdR 摻入增加; 大黃素抑制TNF-α刺激的MC [ 3H] TdR 摻入, 隨著大黃素劑量的增加, 此抑制作用愈強(qiáng)。見表1。

2 . 2 大黃素對(duì)TNF-α刺激的MC 中p27 水平的影響TNF-α刺激24 h 的MC 中p27 水平明顯下降;大黃素提高TNF-α刺激的MC 中p27 水平, 隨著大黃素劑量的增加, 其提高p27 水平的作用愈強(qiáng)。見圖1、表2。

3 討論

MC 增生是各種腎炎、腎病綜合征等腎臟疾病的常見病理現(xiàn)象, 增生的MC 分泌較多的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白, 因此MC 增生長(zhǎng)期存在可導(dǎo)致腎臟纖維化, 以至腎衰竭, 抑制系膜細(xì)胞增生對(duì)預(yù)防腎衰竭有重要的意義。大黃素是中藥大黃的活性單體成分, 其結(jié)構(gòu)為1 , 6, 8-三羥基-3- 4 甲基蒽醌。本實(shí)驗(yàn)證實(shí),TNF-α使無血清培養(yǎng)24 h 的MC 中[ 3H] TdR 摻入增加, 大黃素抑制TNF-α刺激的MC [ 3 H] TdR 摻入, 隨著大黃素劑量的增加, 此抑制作用愈強(qiáng), 提示大黃素可抑制TNF-α誘導(dǎo)的MC 增生。體內(nèi)外研究也證實(shí)大黃素能有效抑制腎MC、成纖維細(xì)胞的增生[ 1 ～4 ] 。大黃素可抑制系膜細(xì)胞增生、降低細(xì)胞增殖性核抗原( proliferating cell nuclear antigen, PCNA) 表達(dá)[ 1] ; 可使抗腎小球基底膜腎炎大鼠腎小球細(xì)胞總數(shù)及新月體數(shù)減少[ 2 ] ; 可通過抑制人腎成纖維細(xì)胞DNA合成, 延遲細(xì)胞周期的進(jìn)程, 抑制細(xì)胞增生[ 3 , 4 ] 。調(diào)節(jié)細(xì)胞是否增生( 細(xì)胞能否通過細(xì)胞周期中的G1 /S 檢驗(yàn)點(diǎn)) 的物質(zhì)是CCRPs。CCRPs 分為正CCRPs( 周期素, 周期素依賴性激酶) 及負(fù)CCRPs( 周期素激酶抑制劑) 。前者的主要生物效能為促進(jìn)細(xì)胞周期的運(yùn)轉(zhuǎn), 而后者的主要生物效能為抑制細(xì)胞周期的運(yùn)轉(zhuǎn)[ 5 ] 。如果周期素激酶抑制劑( cyclin-kinase inhibitor, CKI) 對(duì)G1 / S 轉(zhuǎn)換的抑制作用小于正CCRPs 的促進(jìn)作用, 則細(xì)胞增生。

本研究發(fā)現(xiàn), TNF-α刺激的MC 中p27 水平明顯下降, 大黃素提高TNF-α刺激的MC 中p27 水平,隨著大黃素劑量的增加, 其提高p27 水平的作用愈強(qiáng), 這些結(jié)果提示大黃素可提高TNF-α刺激的MC中p27 水平, 而p27 水平的上升抑制了G1 /S 的轉(zhuǎn)換, 從而抑制MC 的增生。Terada 等[ 10] 證實(shí)舒降之( lovastatin) 通過提高p27 蛋白水平抑制MC 的增

生, 該結(jié)果支持大黃素可能通過提高p27 水平抑制TNF-α刺激的MC 增生。目前不清楚大黃素提高M(jìn)C 中p27 水平的機(jī)制。有報(bào)道認(rèn)為大黃素阻滯鈣通道, 使鈣內(nèi)流受阻, 影響CCRPs 的表達(dá)或降解[ 11 , 12 ] , 從而可能引起p27 水平的下降。

總之, 大黃素可使TNF-α刺激的MC [ 3 H] TdR摻入減少及p27 水平升高, 隨著大黃素劑量的增加,其上述作用愈強(qiáng), 提示p27 水平上升可能在大黃素抑制TNF-α誘導(dǎo)的MC 增生中起重要作用。

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12 Short AD, Bian J, Ghosh TK, et a l. Intracellular Ca2 + pool content is linked to control of cell growth [ J ] . Proc Natl Acad Sci USA,1993, 90( 11) : 4986- 4990.

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