高效液相色譜法測定豚草莖中綠原酸含量的研究 | 高效液相色譜法測定豚草莖中綠原酸含量的研究 |
| 發(fā)布時間:2010-11-15 信息來源:admin 發(fā)布人:admin 點擊次數(shù):2632 |
趙昕 袁曉穎 付玉杰 張瑩 (東北林業(yè)大學森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室，哈爾濱150040) 摘要：以高效液相色譜法作為綠原酸含量的檢測方法，用超聲提取法從豚蘋莖中提取綠原酸以制備分析樣品，結果表明超聲提取的最佳條件為：以蒸餾水為提取溶劑，在60℃下超聲提取70min。 關鍵詞：豚草；綠原酸含量；超聲波提取法；高效液相色譜法 綠原酸(Chlorogenic acid)是由咖啡酸(eaffeiacid)勺奎尼酸(quinic acid)組成的縮酚酸，是植物體在有氧呼吸過程中經(jīng)莽草酸途徑產(chǎn)生的一種苯丙索類化臺物。醫(yī)學上具有利膽，抗菌，降壓，增高白血球及興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等多種藥理的作用[1]。為眾多藥材(如金銀花、杜仲)以及中成藥(如復肝寧、粉刺口服液等)的主要成分。因此探討制備綠原酸分析樣品的最適提取工藝條件對于其他富含綠原酸的植物資源的利用有著重要的指導意義。 近年來綠原酸含量的提取方法主要有水提醇沉[1]、醇提鉛沉、水提石灰乳沉淀法等[3]。水提醇沉使得綠原酸在提取過程中有一些損失，醇提鉛沉給產(chǎn)品帶來重金屬鉛的污染，水提自-灰乳沉淀法存在著得率較低、易分解的缺點。以上提取方法作為綠原酸分析樣品的提取方法存在結果偏低的問題．故本文以高效液相色潛法[3,5-7]作為測定豚草莖中綠原酸含量的方法，以水為溶劑超聲提取和95％乙醇為夾帶荊超臨界萃取豚草莖中綠原酸制備了分析樣品，測定了豚草莖中綠原酸含量。 l儀器和材料 DK-98-1電子恒溫水浴鍋，JASCO高效滴褶色譜儀，975型紫外檢測器，BIOFUGE22R高速冷凍離心機，ABl04型電子天平，PHARMARIA恒溫水浴，DS-300A超聲波清洗機，HALZL-50- Ol超臨界CO：蘋取儀。乙腈、甲醇為色譜純．其余試劑均為分析純。綠原酸標準樣品由中國藥品生物制品檢定所提供．豚草于2001年8月采于牡丹江地區(qū)，取其莖于80％烘干至恒重，粉碎至40目。 2實驗方法 2．1 綠原酸含量的高效液相色潛分析 2.1.1色譜條件 色譜柱KYATECH(日本)ODS柱(4．6mm×25cm，5Um)；流動相：乙腈：水：冰乙酸(體積比)=10：90：5；流速：lmL／min；檢測波長：325 nm；進樣量10uL。 2.1.2標準溶液的配制 精密稱取綠原酸標準樣品10mg于100mL容量瓶中，以甲醇為溶劑超聲助溶，待冷卻至室溫定容，備用。 2.1.3標準曲線的繪制 分別精密吸取綠原酸標準溶液0.125、0.25、0.5、 1、2、4、6、8mI．于10mL容量瓶中，用甲醇稀釋量劉度搖勻。按照上述色譜條件分別取稀釋后樣^6及原標準溶液進樣分析。每個樣重復三次，取峰嘶積平均值，得峰面積(Y)與綠原酸濃度（X）的線性回歸方程為：Y=2×107X一3l 962，相關系數(shù)R=0．999。在該條件下，綠原酸濃度的線性范圍為0．001 25～0．01 mg／mL。 2．1．4綠原酸提取率的測定 將超聲法提取并定容后的樣品在上述色譜繁件下分析后．按下面公式計算綠原酸的提取率：綠原酸提取率‰=綠原酸濃度×提取液體積／豚草莖粉質量×1000 2．2分析樣品的制備 2．2．1超聲提取法 精密稱取豚草莖粉10克于100mL錐形瓶中，加60ml。蒸餾水，提取溫度、提取時間按2因素Ⅱ水平UⅡ*(11 2)的均勻實驗設謗進行，每個樣作三次重復，將提取液移人25mL定容瓶中冷卻至室溫，再用蒸餾水定容至刻度，15 000r／min離心20min，靜置取七清液．在上述HPLC條件F檢測，每個樣重復測三次，計算綠原酸提取率。 2．2．2超臨界萃取法 用95％乙醇溶液200ral。浸潤豚草莖粉200克，24小時后在30Mpa壓力、60℃下萃取90 min，15 000r／min離心20min，靜置取上清液，在上述HPLC條件下檢測，每個樣重復測三次，計算綠原酸提取率。 2．3精密度 精密稱取5份豚草莖粉，每份10克，按照確定的方法制備分析樣品，并在選定的色譜條件下分析綠原酸的含量，測得平均提取率0．040 3‰．相對標準偏差為1．24見表1。
2.4回收率測定 精密稱取3份豚草莖粉．每份50克，分別加入綠原酸標準晶2毫克。按照確定的方法制備分析樣品，并在選定的色譜條件下分析綠原酸的含量，測得平均阿收率96．1％見表2。 3結果與討論 3．1 結果 通過均勻實驗的結果分析表明，超聲提取的最佳條件是以水作為溶劑，在60℃下提取70min。在最佳條件下測得豚草莖中綠原酸提取率0．0407‰。以95％乙醇為夾帶劑超臨界CO2萃取豚草莖中綠原酸，測得提取率為0.001877‰ 4討論 實驗是通過UⅡ*(11 2)均勻實驗沒計表(見表3)進行的，連同結果一并列于表中。
對結果進行逐步回歸分析(引入變量F 檢驗值F1=0.050，剔除變量F一檢驗值F2=0.050)得如下回歸方程：Y=0.044 216 1一O．001 784 0X1一0 000 318 0X2+0．000 027 4X1X1+0．000 0071X1X2 +0.000 000 6X2X2置其中：X1一提取溫度X2一提取時間 回歸方程的F=5，642 3>Fa(0．050 0)=5 050 0顯著．回歸方程有意義。復相關系數(shù) R=0．921 7，殘差標準差S=0．006 7，殘差平方和SE=0．000 2，通過回歸方程的計算可以
得出在60℃時提取率最大，即最優(yōu)解X1=60，X2=110。對影響綠原酸提取率的各因素進行逐步回歸模型分析，得到各因素對綠原酸提取率影響的變化曲線圖(圖1、圖2)。從圖中可以看出，提取溫度對提取率的影響較大，并且呈現(xiàn)從1O℃至25℃提取率逐漸降低，在25％時提取率達到最低，超過25％隨溫度的不斷升高提取率逐漸升高，但溫度過高對植物的次生代謝產(chǎn)物會有影響，因此，溫煌不宜選取過高以60％為宜。提取時間對綠原酸提取率的影響不大。以95％乙醇為夾帶劑超臨界CO2萃取豚草莖中綠原酸，測得提取率為0．001 877‰，可見超聲提取法的得率明顯高于超臨界CO2萃取法的得率，而且具有操作簡單，提取原料成本低，提取時間短的優(yōu)點。 參考文獻 1．戚向陽，張聲華．杜仲葉綠原酸的提取、分離和鑒定，植物資源與環(huán)境，1998．7(1)：6l～62 2，高錦明，張鞍靈，張康健，等．綠原酸的分布、提取與生物活性研究綜述，西北林學院學報，1999，14(2)：7{～82 3．鄭榮慶，李光秀．高技液相色譜法在中藥材資源開發(fā)等方面的應用．西北藥學雜志，1994，9(4)：183～1．84 4李穩(wěn)宏，吳紅．季多偉，等．阿種醇沉方式對杜仲水捉液中綠原酸含量的影響．陜西師范大學學報(自然科學版)，1997，25(1)：65～66 5．伺心，石春偉，蘆松萍．等．高教液相色譜法測定雙黃璉粉針中綠原酸和咖啡酸吉量．藥物分析雜志．1997，17(6)：410—411 6．孫永定，文旭．中成藥的優(yōu)良度——含量測定問題云南中醫(yī)學院學報，(995，18(4)：13～18 7．王天志，李永梅，王志宵．金銀花中3種有機酸的高效液相定量分析．藥物分析雜志，2(X)0，20(5)，293～29 8王洋．張璞，于濤．等．高效液相色譜法測定紅景天甙含量方法的研究植物研究，200(．21(1)113—115 產(chǎn)品鏈接： 杜仲提取物 綠原酸 金銀花提取物 苦杏仁苷 枇杷葉提取物-熊果酸 大花紫薇提取物-科羅索酸 上禾生物 專注植提 精于高純 基于您對天然產(chǎn)物需求持續(xù)創(chuàng)新 |
