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彭密軍1,2 ，張敏1，劉建蘭1，周春山2(1．吉首大學(xué)，湖南張家界427000；2．中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410083)

[摘要] 目的：建立杜仲顆粒中兩種活性成分京尼平苷酸和綠原酸快速、同時(shí)測(cè)定的方法。方法：采用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)測(cè)定，C18色譜柱(250mm×4．6mm，5 m)，甲醇-水-冰乙酸(14.5：85：0.5)為流動(dòng)相，流速1 mL·min-1 ，柱溫25℃ ，檢測(cè)波長(zhǎng)236 nm，靈敏度：0．08 AUFS，進(jìn)樣體積6ul。結(jié)果：該方法線性關(guān)系良好，京尼平苷酸和綠原酸的回收率分別為99.03 ，99.99 ，測(cè)定結(jié)果RSD分別為0.134％ ，1.72%。結(jié)論：該法快速、可靠、簡(jiǎn)單、靈敏度高。

[關(guān)鍵詞] 高效液相色譜法；杜仲顆粒；京尼平苷酸；綠原酸

杜仲顆粒系中成藥，主要含杜仲皮和杜仲葉提取GPA)和綠原酸(chlorogenic acid，CGA)。該制劑能夠增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，對(duì)細(xì)胞免疫功能具有雙向調(diào)節(jié)作用；并有利尿、鎮(zhèn)靜及抑制腸道對(duì)膽固醇吸收的作用；還可調(diào)節(jié)子宮收縮，對(duì)先兆流產(chǎn)有很好的療效；具有緩和而持久的降壓作用[1~3]，并能與自由基結(jié)合抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，起到抗衰老作用[4~7]。本研究采用RP_HPLC法對(duì)杜仲顆粒中的兩種主要活性成分GPA和CGA的含量進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

Biotronik液相色譜分析儀(德國BIoTRoNIK公司)。綠原酸對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所)；京尼平苷酸標(biāo)準(zhǔn)樣品(日本和光純藥業(yè)株式會(huì)社)；杜仲顆粒(貴州天方藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：020422，020426，020428)；純化水，乙醇，甲醇，冰醋酸為分析純。試劑配制后應(yīng)當(dāng)用0．45 m微孑L濾膜過濾。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

2．1．1 色譜條件色譜柱：Polygosil C 8色譜柱(250mm×4．6 mm，5 m)；流動(dòng)相：甲醇一水一冰乙酸(14．5：85：0．5)；流速：1．0 mL·min-1，柱溫：25℃ ，檢測(cè)波長(zhǎng)：236 nm；靈敏度：0．08 AUFS；進(jìn)樣體積6 ul。色譜圖見圖1。

2．1．2 系統(tǒng)適用性色譜柱理論塔板數(shù)(N)按京尼平苷酸計(jì)酸為5200，與相鄰峰分離度≥ 1．5，拖尾因子為1.15；按綠原酸計(jì)算N為5500，拖尾因子為1.08。

2．1．3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇分別取綠原酸和京尼平苷酸對(duì)照品溶液于紫外光區(qū)190~400 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，CGA的最大吸收波長(zhǎng)在325 nm，第二吸收波長(zhǎng)為238 nm，GPA的最大吸收波長(zhǎng)則在235 nm左右，確定236 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2．2 對(duì)照品溶液的制備準(zhǔn)確稱取GPA對(duì)照品6．8mg、CGA對(duì)照品7．1 mg，用色譜純甲醇溶解并定容至5 mL，得到濃度為1．36 g·L-1的GPA、1．42 g·L-1的CGA對(duì)照品混合儲(chǔ)備液，冷藏保存。

2．3 樣品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取0.1 g杜仲顆粒樣品，加人適量50 的甲醇一水溶液，超聲溶解20 min 2次，移人25 mL量瓶中，再用50%的甲醇一水溶液定容至刻度，搖勻，過濾。準(zhǔn)確吸取濾液1.0 mL于10mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋、定容至刻度，搖勻。用0．45um濾膜過濾后，即得待測(cè)液。

2．4 線性關(guān)系考察取對(duì)照品儲(chǔ)備液用流動(dòng)相溶液稀釋，配制成對(duì)照品系列混合溶液，GPA：0．034，0．068，0．136，0．272，0．544 g ·I -1 ；CGA ：0．034，0．071，0．142，0．284，0．568 g·L-1。各進(jìn)樣6ul，平行5次。結(jié)果GPA和CGA的峰面積y與其進(jìn)樣濃

度X(g·L-1)存在良好的線性關(guān)系：

CGA ：Y = 一608 71+ 4 322 500X ，r= 0．998 6，線性范圍：0．036~0．568 g·L-1

GPA：Y = 一377 20+ 6 043 800X ，r= 0．996 9，線性范圍：0．034~0．544 g·L-1

2．5 精密度試驗(yàn)精密吸取GPA含量為0．080 g·L-1；CGA為0．072 g·L-1 的樣品溶液6 ul，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)得RSD分別為：GPA 0．61 %，CGA 0．72 %(n= 5)。

2．6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精密吸取GPA含量為0．080 g·L-1；CGA為0．072 g·L-1的混合溶液6 ul，每間隔一段時(shí)間進(jìn)樣測(cè)定一次，實(shí)驗(yàn)表明，該混合溶液在10 d內(nèi)基本穩(wěn)定。

2．7 加標(biāo)回收率測(cè)定精密稱取適量的已測(cè)定含量的樣品5份，分別加人一定量的GPA、CGA對(duì)照品，采用2．3方法制備樣品，過濾后分析，測(cè)定回收率，結(jié)果平均含量分別為99.03%，99.99%。

2．8 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2．3”項(xiàng)制備杜仲顆粒樣品溶液，進(jìn)樣6 ul，重復(fù)5次。試驗(yàn)結(jié)果測(cè)得GPA，CGA含量分別為0．799，0．712 mg·g-1，RSD 分別為0.134%，1.72%。

2．9 樣品的測(cè)定分別對(duì)3批杜仲顆粒樣品進(jìn)行測(cè)定，各樣品中GPA、CGA的含量測(cè)定結(jié)果見表1。

3 討論

3．1 樣品提取方法的選擇取同一樣品4份，分別加甲醇、乙醇、50％的甲醇及50%的乙醇同時(shí)超聲波提取20 min提取，各兩次，合并后測(cè)定其中GPA 和CGA含量。結(jié)果表明，50%的甲醇提取率最高，提取最完全，所以確定用50%的甲醇為提取溶劑。

3.2 測(cè)定方法的選擇GPA及CGA的測(cè)定方法主要有分光光度法，薄層色譜法和高效液相色譜法等[3-8]。大多是對(duì)杜仲中的兩種成分分別進(jìn)行分析測(cè)定，而對(duì)杜仲制劑中的這兩種化合物同時(shí)進(jìn)行測(cè)定的方法未見有報(bào)道。高效液相色譜法能分離并檢測(cè)各個(gè)有關(guān)組分，而且方法快速、準(zhǔn)確。

3．3 流動(dòng)相的選擇 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，僅以不同比例的甲醇一水為流動(dòng)相，由于兩種組分都有羧基，極性均很強(qiáng)，在C 18柱上都不易保留，很快被流動(dòng)相洗脫下來，難以完全分離。流動(dòng)相中加入醋酸，可抑制GPA 和CGA羧基的離解，延長(zhǎng)其保留時(shí)間，從而使之與其他雜質(zhì)分

離徹底。兩色譜峰峰形都有所改善，所得色譜圖峰形對(duì)稱。甲醇一水一醋酸的比例為14．5：85：0．5時(shí)，所測(cè)定組分與附近分離較好，整個(gè)分析時(shí)間也較適宜(35 min可完成)。

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