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李剛，鄭作文，唐云麗(1.廣西中醫(yī)學院，南寧市530001；2.廣西桂林市人

民醫(yī)院，桂林市541002)

摘要  目的:研究藤茶總黃酮體外抗人肝癌細胞的作用。方法:以MTT法、細胞生長曲線法、集落形成法觀察藤茶提取物對人肝癌BEL7404細胞的體外抑制作用。結果:藤茶總黃酮能顯著抑制體外培養(yǎng)的BEL7404細胞的生長。MTT法測得的半數(shù)抑制濃度(IC50)為28.59μg·mL-1；細胞生長曲線法提示藤茶總黃酮對BEL7404細胞的生長有顯著的抑制作用；集落形成法提示當藥物濃度在22.22μg·mL-1以上時IC50為100%，當藥物濃度在14.81μg·mL-1時IC50為58.05%。結論:藤茶總黃酮對體外培養(yǎng)的BEL7404細胞有顯著的抑制作用。

關鍵詞  藤茶總黃酮；人肝癌BEL7404細胞；體外抑制作用

藤茶Ampelopsisgrossedentata系葡萄科蛇葡萄屬植物顯齒蛇葡萄的嫩莖葉[1]。從藤茶中提取的總黃酮具有調節(jié)血糖和血脂、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多項藥理作用[2~4]。本文對藤茶總黃酮進行抗人肝癌BEL7404細胞的研究，以期為臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Sunrise型自動酶標儀(奧地利Tecan公司)；311型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國ThermoForma公司)；DLF560型超凈工作臺(荷蘭ClearAirTechniekBv公司)；細胞培養(yǎng)瓶(加拿大Biofil公司)；96孔板(上海Sunub科技發(fā)展公司)；倒置顯微鏡(廣西梧州光學儀器廠)；微量移液器(法國Pipetman公司)；十萬分之一電子天平(德國賽多利斯公司)。

1.2 試藥

藤茶總黃酮由廣西中醫(yī)學院中藥化學教研室通過柱層折提取分離，為粉狀淡黃色結晶，經(jīng)含量測定，純度為91.1%；RPMI-1640干粉(美國Gibco公司)；新生牛血清(杭州四季青公司，批號:031101)；MTT(北京拜爾迪生物公司，批號:0793)；二甲基亞砜(上海博大泰克公司)；0.25%胰蛋白酶(美國HycloneLab公司)；注射用生理鹽水(徐州萊恩藥業(yè)公司，批號:051122)。

1.3 細胞

人肝癌BEL7404細胞，由廣西中醫(yī)學院分子生物學實驗中心惠贈。

2 方法與結果

2.1 BEL7404細胞的培養(yǎng)

在長滿BEL7404細胞的培養(yǎng)瓶內(nèi)加0.25%胰酶，37℃消化3~4min；1∶3傳代，3~5d

長滿。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 MTT法測定半數(shù)抑制濃度(IC50)[5]

取對數(shù)生長期的細胞消化，配制成1×104個·mL-1細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔180μL。設6個濃度的藥物組及細胞對照組，每濃度4個復孔。藥物組加不同濃度的藤茶總黃酮，每孔20μL，使其終濃度分別為75、50、33.33、22.22、14.81、9.88μg·mL-1；細胞對照組加培養(yǎng)液20μL。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)48h；取出，加MTT(5mg·mL-1，生理鹽水配制)，每孔10μL；繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清液，加入不含血清的1640培養(yǎng)液，每孔150μL，洗板1次；棄上清液，加入二甲基亞砜，震蕩。在550nm波長處用酶標儀測吸光度(OD)值，計算抑制率，用對數(shù)回歸方程求出IC50。腫瘤細胞生長抑制率按下式計算:腫瘤細胞生長抑制率=(1試驗組平均OD值/對照組平均OD值)×100%。MTT法測定藤茶總黃酮對BEL7404細胞的抑制作用詳見表1。

由表1可知，當藤茶總黃酮終濃度為75.00、50.00、33.33、22.22μg·mL-1時，抑瘤率

與細胞對照組比較有顯著性差異(P<0.01)；按對數(shù)回歸方程計算(r=95%)，其IC50為28.59

μg·mL-1，提示藤茶總黃酮有較強的體外抑制BEL7404細胞作用。2.3 生長曲線法測定[5]取對數(shù)生長期的細胞消化，配制成1×104個·mL-1細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔180μL。設6個濃度的藥物組及細胞對照組，每濃度4個復孔。藥物組加不同濃度的藤茶總黃酮，每孔20μL，使其終濃度分別為50、33.33、22.22、14.81、9.88、6.58μg·mL-1；細胞對照組加1640培養(yǎng)液20μL。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于用藥后第0、1、2、3、4天用臺盼藍拒染法進行活細胞計數(shù)。以每1mL活細胞數(shù)為縱坐標，時間為橫坐標繪制細胞生長曲線。生長曲線法測定藤茶總黃酮對BEL7404細胞的抑制作用詳見表2。

由表2可知，細胞培養(yǎng)第1、2天時，濃度為50.00、33.33μg·mL-1的藤茶總黃酮的抑瘤率與細胞對照組比較有顯著性差異(P<0.01)；培養(yǎng)第3、4天時，濃度為50.00、33.33、22.22μg·mL-1的藤茶總黃酮的抑瘤率與細胞對照組比較有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。結果提示，藤茶總黃酮對培養(yǎng)的BEL7404細胞的增殖表現(xiàn)出顯著的抑制作用，且成濃度-效

應關系。

2.4 集落形成法測定[5]

取對數(shù)生長期的單層培養(yǎng)細胞，用0.25%胰酶溶液消化并吹打成單個分散細胞懸液，進行活細胞記數(shù)。用含10%新生牛血清的1640培養(yǎng)液稀釋成100個·mL-1細胞，接種于24孔板中，每孔加入1mL細胞，后加入不同濃度的藤茶總黃酮，每孔1mL，使其終濃度分別為75、50、33.33、22.22、14.81μg·mL-1，每個濃度均設3個復孔；細胞對照組加1640培養(yǎng)液1mL，混勻。將24孔板移入CO2箱，在37℃、5%CO2及飽和濕度環(huán)境下，靜置培養(yǎng)8d。棄去培養(yǎng)液，用姬姆薩應用液染色，在鏡下計數(shù)大于50個細胞的克隆數(shù)。抑制率(%)=(1試驗組克隆數(shù)/對照組克隆數(shù))×100%。集落形成法測定藤茶總黃酮對BEL7404細胞的抑制作用詳見表3。

由表3可知，當藤茶總黃酮終濃度為50.00、33.33、22.22μg·mL-1時，抑制率為100%；

當藤茶總黃酮終濃度為14.81μg·mL-1時，抑制率為58.05%。提示藤茶總黃酮有顯著的抑制BEL7404細胞的作用。

3 討論

惡性腫瘤是危害人類健康和生命的主要疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織1976年估計，全世界每年約有500萬左右的人死于惡性腫瘤。近幾十年來， 由于生態(tài)環(huán)境的不斷惡化、艾滋病等疾病的傳播，惡性腫瘤的發(fā)病率呈上升趨勢，并成為繼心血管疾病之后的第二大致死病因。

目前，對腫瘤的治療手段有顯著進步，但對危害人類生命健康最嚴重的、占惡性腫瘤90%以上的實體瘤的治療尚未能達到令人滿意的效果[6]。因此，從天然中草藥中尋找有效的抗癌藥物越來越受到人們的關注。本文采用MTT法、細胞生長曲線法、集落形成法對藤茶提取物體外抗腫瘤的作用進行了試驗研究，結果顯示，藤茶總黃酮體外對人肝癌BEL7404細胞的增殖有顯著抑制作用。至于其體內(nèi)抑瘤實驗還有待進一步研究。

參考文獻

[1] 中國科學院植物研究所.中國高等植物圖鑒(第2冊)[M].北京:科學出版社，1983:349~356.

[2] 鐘正賢，陳學芬，周桂芬，等.廣西藤茶提取物的藥理研究[J].廣西科學，1999，6(3):216.

[3] 鐘正賢，周桂芬，陳學芬，等.藤茶提取物對鏈脲霉素所致糖尿病大鼠的降糖作用[J].中藥藥理與臨床，2003，19(5):19.

[4] 朱海升，劉鄂湖，鞠娟，等.抗老年性癡呆的天然藥物研究進展[J].中國藥房，2007，18(3):223.

[5] 徐叔云，卞如濂，陳修主編.藥理實驗方法學[M].第3版.北京:人民衛(wèi)生出版社， 2005:1785.

[6] 卜平.細胞信號轉導與抗腫瘤中藥開發(fā)(上)[J].江蘇中醫(yī)藥，2003，24(4):1.