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(11黑龍江畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院,黑龍江雙城　150111; 21雙城市畜牧局)

摘　要: 　通過對金銀花、蒲公英、連翹、紫花地丁、丹參五味中藥組成的復(fù)方(自擬方)分別采取水提、水醇提取、醇水提取、超聲波強化浸出四種不同的提取方法,建立紫外分光光度法,在327 nm波長處測定四種提取方法中綠原酸的含量分別為10. 0167、6. 9333、7. 400、9. 6333 mg/g原藥材;綠原酸提取率分別為32. 52%、22. 52%、24. 03%、31. 28%;得膏率分別為25. 3%、18. 70%、14. 0%、16. 4%。結(jié)果水提和超聲波強化浸出兩種工藝提取效果較好。

關(guān)鍵詞: 　金銀花;綠原酸;提取工藝

金銀花的有效成分主要是綠原酸與異綠原酸等[ 1, 2 ] ,而蒲公英中也分得綠原酸,并將其含量作為蒲公英藥材及其中成藥制劑的質(zhì)量控制[ 3 ] ,該成分對奶牛乳房炎病原體具有明顯的抑制作用。因此,進行綠原酸提取工藝的研究,篩選最佳提取工藝,以確保金銀花及其制劑的臨床療效具有重要意義。該實驗以綠原酸提取率和得膏率作為考核指標,考察了不同的提取工藝。

1　儀器與藥品

島津分光光度計(UV - 120 - 02) 、KQ3200超聲波清洗器、電子分析天平、電熱恒溫水浴鍋、回流裝置、真空冷凍干燥機(ALPHA I - 5) 、離心機等。綠原酸對照品由中國藥品生物制品檢定所提供,批號0753 - 200111。甲醇、95%乙醇均為分析純,蒸餾水。金銀花(巨鹿) 、蒲公英(黑龍江) 、連翹(山西) 、丹參(河北) 、紫花地丁(黑龍江) 。

2　方法與結(jié)果

2. 1　提取工藝及干浸膏的制備

2. 1. 1　水提工藝　將蒲公英、金銀花、連翹、丹參、紫花地丁加8倍量水(125 + 8) ,不浸泡,直接煎煮2次,每次1 h,合并提取液,紗布脫脂棉濾過, 2 000 r/min離心10 min,取上清液,常壓加熱(70～80 ℃)濃縮至稠膏狀,于60 ℃真空干燥,得干浸膏。

2. 1. 2　水醇法　將蒲公英、金銀花、連翹、丹參、紫花地丁加8倍量水,煮沸2次,每次1 h,合并兩次提取液,紗布脫脂棉過濾,加熱濃縮至每毫升相當于原藥材1 g (70～80 ℃) 。加95%乙醇,使溶液含醇量達85% ,放置過夜,取上層醇液,下層2 000 r/min離心10 min,取上清液與前液合并,回收乙醇濃縮至無醇味呈稠膏狀,于60 ℃真空干燥,得干浸膏。

2. 1. 3　醇水法　將蒲公英、金銀花、連翹、丹參、紫花地丁分別粉碎過24目篩,混勻,取粗粉125 g,先用適量95%乙醇浸濕,再按6倍量用95%乙醇,回流提取2次,每次1 h,合并醇提液,濃縮回收乙醇至無醇味,加4倍藥量的水,放置過夜,濾取上清液,下層2 000 r/min離心10 min,取上清液與前液合并,濃縮至稠膏狀,于60 ℃真空干燥,得干浸膏。

2. 1. 4　超聲波強化浸出法　將蒲公英、金銀花、連翹、丹參、紫花地丁分別粉碎過24目篩,混勻,取粗粉125 g,置于有蓋容器中(用廣口瓶) ,加入70%乙醇625 ml,密封,置超聲清洗機 (工作頻率為50 kHZ,輸出功率120W,溫度60 ℃)的清洗糟內(nèi)水溶液中,超聲浸出2 h,停機,傾取上層清液,用紗布過濾,殘渣用力壓榨(用瓶子擠壓) ,壓出殘液,與濾液合并,濃縮回收乙醇至無醇味呈稠膏狀,于60 ℃真空干燥,得干浸膏。

2. 1. 5　4種不同提取方法所得干浸膏率見表1。

2. 2　綠原酸含量測定

2. 2. 1　標準曲線　回歸方程的建立、精密稱取綠原酸對照品4 mg,置棕色量瓶中,加50%甲醇溶液100 ml至刻度,然后再梯度稀釋,使每1 ml含綠原酸0. 04、0. 02、0. 01、0. 005mg系列濃度,即得標準品溶液(10 ℃以下保存) 。采用紫外分光光度法,在310～340 nm波長處測定其吸光度,以波長為橫坐標,吸光度為縱坐標,得吸收曲線, 327 nm為最大吸收波長(見圖1) 。

    在波長327 nm處測定四種濃度的綠原酸吸光度(A) 。用已知濃度C1、C2、C3、C4 為橫坐標, A1、A2、A3、A4 為縱坐標,繪制標準曲線, 得回歸方程: y = 37. 176x - 01033, r =

019995 ( n = 4) ,由此可見,綠原酸含量在0. 04～0. 005 mg/ml之間呈良好的線性關(guān)系(見圖2) 。

2. 2. 2　精密度試驗　按上法對同一標準品溶液平行測定5次,其綠原酸含量的RSD為1.95% ,表明本法具有較好的精密度。

2. 2. 3　不同提取工藝供試品溶液的制備　分別取不同工藝相當于原藥材0. 5 g的復(fù)方中藥干浸膏,精密稱定,置25ml棕色容量瓶中,加50%甲醇約20 ml,超聲處理30 min,冷卻,加50%甲醇至刻度,搖勻, 4 000 r/min離心10 min,精密量取上清液5 ml,置50 ml棕色容量瓶中,加50%甲醇至刻度,搖勻,作為不同提取工藝供試品溶液。

2. 2. 4　復(fù)方中藥對照品藥材溶液的制備　取復(fù)方中藥對照品藥材5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加50%甲醇500 ml,稱定重量,超聲處理30 min,冷卻,再稱定重量,用50%甲醇補足減失的重量,搖勻,過濾, 4 000 r/min離心10 min,精密量取上清液5 ml,置50 ml棕色容量瓶中,加50%甲醇至刻度,搖勻,作為復(fù)方中藥對照品藥材溶液。

在327 nm波長處測定吸光度,依回歸方程計算樣品和對照品藥材中綠原酸的含量,以水提工藝和超聲波強化浸出法綠原酸的提取率較高。結(jié)果見表2。

3　討論

3. 1　四種方法所得干浸膏率以水提工藝較高,因為在水煮過程中,有效成分提取出來的同時,許多雜質(zhì)如淀粉、多糖類、蛋白質(zhì)、黏液質(zhì)、鞣質(zhì)、樹膠、無機鹽類等也被提取出來,盡管通過離心除去大部分,但仍有少量留在了提取液中;其次是水醇法,因藥材水煮后,加入乙醇可將部分或大部分淀粉、多糖、蛋白質(zhì)沉淀除去,但對鞣質(zhì)、色素、樹脂等不易除去,留在了提取液中。

3. 2　四種方法綠原酸的提取率均低,但以水提工藝和超聲波強化浸出法相對較高。由于綠原酸的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定性差,在提取過程中受時間、溫度、濃縮方式等影響較大,使其在原藥材中的含量損失隨溫度升高、時間延長而逐步增加[ 1, 5 ]。

所以,對金銀花、蒲公英這樣已經(jīng)明確有效成分和防治功效的中草藥,應(yīng)該利用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù),對其有效成分進行提取、分離。這樣既有利于有效成分藥理作用機制的研究,又能提高中草藥制劑的質(zhì)量。

參考文獻:

[ 1 ] 張　玲,尚立霞,單衛(wèi)華,等. 金銀花提取工藝研究[ J ].中藥新藥與臨床藥理, 2003, 14 (1) : 59～61.

[ 2 ]丁利君,吳振輝,蔡創(chuàng)海,等. 金銀花中黃酮類物質(zhì)最佳提取工藝的研究[ J ]. 食品科學(xué), 2002, 23 (2) : 62～65.

[ 3 ]凌　云,范國強,肖　樾,等. 中藥蒲公英的質(zhì)量標準研究 [ J ]. 中草藥, 1999, 30 (12) : 897～899.

[ 4 ]吳國娟,張中文,李煥榮,等. 中藥對奶牛乳房炎6種致病菌的抑菌效果觀察[ J ]. 北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報, 2003, 18 ( 3) :

195～198.

[ 5 ]顧文彬,井山森. 連銀湯提取工藝的正交實驗研究[ J ]. 基層中藥雜志, 2002年, 16 (5) : 13～14.