微柱高效液相色譜法測(cè)定金銀花中的多酚類物質(zhì) | 微柱高效液相色譜法測(cè)定金銀花中的多酚類物質(zhì) |
| 發(fā)布時(shí)間:2010-12-27 信息來(lái)源:admin 發(fā)布人:admin 點(diǎn)擊次數(shù):5963 |
胡秋芬1, 2 楊光宇2 黃章杰2 李海濤1 尹家元2 1 (玉溪師范學(xué)院化學(xué)系, 玉溪653100) 2 (云南大學(xué)化學(xué)系, 昆明650091) 摘 要 研究了用微柱高效液相色譜法測(cè)定金銀花中的幾種多酚類物質(zhì)(氯原酸、木犀草黃素、木犀草黃素272葡萄糖甙、木犀草黃素272半乳糖甙、槲皮素及槲皮素232葡萄糖甙) 的方法。金銀花樣品中的多酚類物質(zhì)用甲醇加熱回流提取,然后以Waters XterraTM RP18 (1. 0 mm ×50 mm, 2. 5 mm)微柱為固定相, 1%的醋酸和甲醇梯度洗脫為流動(dòng)相分離,在該色譜條件下,金銀花中6種多酚類成分在4 min內(nèi)可達(dá)到基線分離;用紫外二極管矩陣檢測(cè)器檢測(cè)。方法標(biāo)準(zhǔn)回收率為97%～104%;相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1. 6%～2. 3%。測(cè)定了幾種金銀花樣品中的多酚類物質(zhì),結(jié)果滿意。 關(guān)鍵詞 高效液相色譜,固相萃取,金銀花,多酚,微柱 1 引 言 金銀花( lonicera japon ica)為忍冬科植物的干燥花蕾,它是一種“藥食同源”的綠色天然產(chǎn)物,在我國(guó)分布廣泛,產(chǎn)量較大,是一種重要的可再生資源[ 1, 2 ] 。多酚類物質(zhì)(主要是黃酮類和氯原酸)是金銀花的主要有效成分。目前對(duì)金銀花中多酚類物質(zhì)的測(cè)定,主要有紫外分光光度法、薄層色譜法、高效液相色譜法和毛細(xì)管電泳法等,其中,高效液相色譜法是最常用的方法[ 3～6 ] 。由于微柱高效液相色譜具有流動(dòng)相消耗少,分析時(shí)間短,可不分流直接和質(zhì)譜聯(lián)用等特點(diǎn),近幾年來(lái)得到了迅速發(fā)展[ 7, 8 ] 。實(shí)驗(yàn)研究了用微柱高效液相色譜分析金銀花中多酚類物質(zhì)的方法,金銀花中6種多酚在4 min內(nèi)可達(dá)到基線分離。方法用于幾種金銀花樣品分析,結(jié)果滿意。 2 實(shí)驗(yàn)部分 2. 1 儀器與試劑 Allaince高效液相色譜2質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Waters公司) ,包括2690分離系統(tǒng)(四元泵、柱溫箱及自動(dòng)進(jìn)樣器) ; 996紫外二極管矩陣檢測(cè)器; TMD 熱束質(zhì)譜檢測(cè)器;Millennium32色譜管理軟件。甲醇:高效液相色譜專用( Fisher公司) ;水為石英亞沸蒸餾水并用Milli2Q50 (美國(guó)Millipore公司) 超純水儀處理,電阻率大于18MΩ·cm;氯原酸,木犀草黃素,木犀草黃素272葡萄糖甙,木犀草黃素272半乳糖甙,槲皮素,槲皮素232葡萄糖甙標(biāo)樣(分別購(gòu)于Fluka公司、Sigma公司和美國(guó)Chromadex公司,含量> 95% ) 。 2. 2 色譜條件 色譜柱:Waters XterraTM RP18 ( 1. 0 mm ×50 mm, 2. 5 μm) , Waters Sep2Pak2C18固相萃取小柱(1 mL, 30 mg, 30μm) ;流動(dòng)相為: A. 甲醇; B. 1%醋酸溶液,按0 min (A 20% + 80%B ) , 1. 5min (A 40% + B 60% ) , 3. 0 min (A 80% + B 20% )的線性梯度條件,流速為0. 2 mL /min;進(jìn)樣體積2. 0 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)為345nm。在上述色譜條件下,樣品和標(biāo)樣的色譜圖見圖1。 2. 3 樣品處理 樣品粉碎后過(guò)0. 45 mm粒徑篩,準(zhǔn)確稱取樣品約0. 4 g,加入45 mL 80%甲醇水溶液加熱回流45min,冷卻,過(guò)濾并定容到50 mL,取5 mL濾液,以10 mL /min流速通過(guò)預(yù)活化好的Waters Sep2Pak2C18固相萃取小柱,棄去最初的3 mL,收集后面的2 mL,用0. 45μm針頭過(guò)濾器過(guò)濾,進(jìn)樣2. 0μL進(jìn)行分析。 3 結(jié)果與討論 3. 1 分離條件的選擇 用甲醇2水作流動(dòng)相時(shí)有的色譜峰稍拖尾。這可能是因?yàn)榉恿u基易產(chǎn)生電離,在固定相
表面有雙重的保留機(jī)制。改用甲醇- 1%醋酸溶液作流動(dòng)相可使酚的電離被抑制,成為中性分子在反相條件下的疏水締合物, 使分離效果和峰型得到較大改善。實(shí)驗(yàn)表明, 按0 min (A 20% + 80% B ) , 1. 5 min (A 40% +B 60% ) , 3. 0 min (A 80% +B 20% )的線性梯度條件可使樣品中的待測(cè)組分達(dá)到基線分離, 3. 2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇由紫外二極管矩陣檢測(cè)器200～400 nm波長(zhǎng)掃描可得各色譜峰的光譜圖(圖2) 。
樣品中各多酚均由其保留時(shí)間及紫外光譜圖與標(biāo)樣對(duì)照確定,并作了峰純度分辨,確認(rèn)各測(cè)定組分均達(dá)到完全分離;由于各多酚類物質(zhì)在345 nm左右均有較大吸收,因此實(shí)驗(yàn)選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為345 nm。 3. 3 樣品前處理 多酚類物質(zhì)在極性有機(jī)溶劑中具有較大的溶解度,在熱甲醇液中溶解性較好,故實(shí)驗(yàn)選用80%甲醇為提取劑。對(duì)于0. 4 g左右的樣品,用40 mL濃度在70%以上的甲醇溶液加熱回流提取0. 5 h以上可提取完全,實(shí)驗(yàn)選用80%甲醇45 mL加熱回流提取45 min。 金銀花中除含有多酚類物質(zhì)外,還含有油脂類物、蠟質(zhì)、色素等弱極性物質(zhì)。該類物質(zhì)會(huì)影響多酚類物質(zhì)的檢測(cè),并且在本實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相條件下不能完全洗脫下,在C18柱上殘留積累,使色譜系統(tǒng)的反壓增大,并降低柱效,故樣品分析前需作脫脂處理。常規(guī)樣品處理采用正己烷、石油醚等非極性有機(jī)溶劑進(jìn)行脫脂,但是用有機(jī)溶劑脫脂時(shí)間長(zhǎng),操作麻煩,還會(huì)在一定程度上造成多酚類物質(zhì)損失,影響分析結(jié)果。因此實(shí)驗(yàn)先用80%甲醇回流提取樣品中的多酚類物質(zhì),提取液用C18固相萃取小柱脫脂的方法。用Waters SPE真空提取裝置,每次可同時(shí)處理20個(gè)樣,小柱活化和樣品預(yù)分離的流速均為10 mL /min,小柱用3 mL甲醇活化,然后用10 mL水洗凈小柱上的甲醇,取80%甲醇的樣品提取液通過(guò)小柱。這樣,弱極性物質(zhì)脂類、蠟質(zhì)、色素等保留在小柱上,而多酚類物質(zhì)在小柱上不保留,可簡(jiǎn)便快速的達(dá)到樣品純化的目的,用固相萃取脫過(guò)脂的樣品可直接進(jìn)樣進(jìn)行色譜分析。 3. 4 回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限 分別配制濃度為100、20、4. 0 和0. 8 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液,進(jìn)樣后根據(jù)不同濃度的峰面積計(jì)算出回歸方程,結(jié)果見表1。根據(jù)信燥比S /N = 3,測(cè)得各組分最低檢測(cè)濃度,結(jié)果見表1。
3. 5 回收率實(shí)驗(yàn)及精密度 準(zhǔn)確稱取相同樣品兩份,其中一份加入已知量多酚標(biāo)樣,另一份不加,每份樣品平行測(cè)定5次,通過(guò)加入標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)出量除以標(biāo)準(zhǔn)加入量計(jì)算回收率,并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,結(jié)果見表2。
3. 6 樣品分析結(jié)果 金銀花樣品采集后按1. 3樣品前處理的方法處理進(jìn)樣分析, 4個(gè)樣品的分析結(jié)果見表3。 本方法采用甲醇回流提取金銀花中的多酚類物質(zhì),用固相萃取預(yù)分離,微柱高效液相色譜法測(cè)定金銀花中的6種多酚類物質(zhì),在4 min內(nèi)可達(dá)到基線分離。分析時(shí)間比常規(guī)色譜柱明顯縮短,而且流動(dòng)相流速只需0. 2 mL /min,比常規(guī)色譜柱(流動(dòng)相流速0. 5～2. 0 mL /min)流動(dòng)
相消耗減少。用固相萃取預(yù)分離脫脂克服了用有機(jī)溶劑脫脂時(shí)間長(zhǎng)、操作麻煩,會(huì)造成多酚類物質(zhì)損失的缺點(diǎn),而且固相萃取易實(shí)現(xiàn)操作自動(dòng)化,使樣品前處理更為簡(jiǎn)便快速,結(jié)果可靠,在一定程度上為金銀花中的多酚類物質(zhì)研究提供了方法。 References 1 Shi Yue (石 鉞) , Shi Renbing (石任兵) , Lu Yunru (陸蘊(yùn)如). Chinese Pharm aceutical Journal (中國(guó)藥學(xué)雜志) , 1999, 34 (11) : 724～727 2 Zhao Guoling (趙國(guó)玲) , L iu J iajia (劉佳佳) , L in Dan (林 丹). Chinese Traditional PatentM edicine (中成藥) , 2002, 24 (12) : 973～976 3 Sun Huiming (孫會(huì)敏) , Xing Cheng (邢 成). Chinese Journal of Pharm aceutical Analysis (藥物分析雜志) , 2003, 23 (1) : 76～77 4 Zeng Xiaoying (曾曉英) , Ni Long (倪 龍) , Wang Baoqin (王保琴). Chinese Journal of D rug S tandards (中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)) , 2002, 3 (1) : 19～22 5 Wang Dexian (王德先) , Zhao J ingxiang (趙敬湘) , Yang Genglian (楊更亮) , Zhang L ing (張 玲). Chinese Tradi2tional and Herbal D rugs (中草藥) , 2000, 31 (6) : 432～438 6 L i Z, Wang L, Yang G Y, Shi H L, J iang C Q, L iuW. Journal of Chrom atographic Science, 2003, 41 (1) : 36～40 7 Fu Ruonong (傅若農(nóng)). Chinese Journal of InternationalAnalytical Instrum entation Technology and Application (國(guó)外分析儀器技術(shù)與應(yīng)用) , 2000, (4) : 1～10 8 Huang Tiehua (黃鐵華). Chinese J. Anal. Chem. (分析化學(xué)) , 1998, 26 (6) : 748～751 產(chǎn)品鏈接： 杜仲提取物 綠原酸 金銀花提取物 苦杏仁苷 枇杷葉提取物-熊果酸 大花紫薇提取物-科羅索酸 上禾生物 專注植提 精于高純 基于您對(duì)天然產(chǎn)物需求持續(xù)創(chuàng)新 |
