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許海棠1, 徐遠(yuǎn)金1 , 2

(1 廣西大學(xué)糖業(yè)工程技術(shù)研究中心 南寧 530004；2 廣西亞熱帶生物資源保護(hù)利用重點實驗室 南寧 530004)

摘要 建立了同時測定蒲公英顆粒中綠原酸、咖啡酸和阿魏酸3 種酚酸物質(zhì)含量的HPLC-MS 方法。樣品用含5%甲酸的甲醇溶液超聲提取后，在Zorbax Eclipse XDB-C18 (2.1 mm ×150 mm, 5 μm)色譜柱上，以含0.2 %甲酸的水(A)-乙腈(B)體系為流動相，進(jìn)行梯度洗脫，線性梯度洗脫程序為：0 min，5% B；1.5 min，10% B；10~15min，40%B；流速：0.25 mL/min；在ESI 正離子模式下，采用選擇性離子監(jiān)測方法進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，綠原酸、咖啡酸和阿魏酸的線性范圍分別為 0.050～20.0、0.030～20.0 和 0.100～20.0 μg/mL，檢出限分別為0.010、0.006 和0.020 μg/mL。平均加標(biāo)回收率為96.4 % ～ 101.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%~2.6%。樣品在10 h 內(nèi)測定基本不變，可用于蒲公英顆粒的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞 蒲公英顆粒綠原酸 咖啡酸 阿魏酸 高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜法

蒲公英顆粒是由蒲公英加蔗糖等輔料制成的顆粒劑，具有清熱消炎的功效，用于治療上呼吸道感染、急性扁桃體炎、癤腫、乳腺炎等。目前，關(guān)于測定蒲公英草藥及其制劑中的綠原酸、咖啡酸和阿魏酸的含量已有報道，例如，曾秋華等用高效液相色譜法測定蒲公英顆粒中的咖啡酸[1]，周小平等以高效液相色譜法測定蒲公英中的綠原酸[2]，晏媛等用高效液相色譜法同時測定蒲公英中咖啡酸和阿魏酸[3], 李文用高效液相色譜法測定蒲公英片中的綠原酸和咖啡酸[4]。但是，尚未見有對蒲公英及其制劑中綠原酸、咖啡酸和阿魏酸這3種酚酸類物質(zhì)同時測定的報道。本文利用高效液相色譜-質(zhì)譜法聯(lián)用技術(shù)，采用選擇性離子監(jiān)測(SIM)方法，建立了HPLC/MS同時測定蒲公英顆粒中綠原酸、咖啡酸和阿魏酸的方法，并已成功地用于藥品蒲公英顆粒的分析。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1100 LC/MSD Trap SL 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(德國)； Waters pro plus 超純水儀(美國)； Sartorius ME 215S 電子分析天平(德國)。乙腈（色譜純，F(xiàn)isher 公司)，其他試劑均為分析純，所有用水均為超純水；對照品綠原酸、咖啡酸、阿魏酸購自中國藥品生物制品檢定所；樣品為安慶匯達(dá)豐藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，規(guī)格為每袋15 克，10 袋/盒，批號分別為20061118、20070129、20070317。

1.2 對照品溶液的制備

分別準(zhǔn)確稱取綠原酸、咖啡酸和阿魏酸對照品各10mg，分別置10 mL 量瓶中，用含5%甲酸的甲醇溶液溶解并定容，振蕩均勻后即得濃度為1.00 mg/mL 的對照品儲備液。其他不同質(zhì)量濃度的對照品溶液由儲備液稀釋得到。由于綠原酸和阿魏酸遇光不穩(wěn)定，操作過程要注意避光，使用前配制。

1.3 供試品溶液的制備

取蒲公英顆粒適量，研細(xì)，混勻，準(zhǔn)確稱取0.400 g 置錐形瓶中，加入含5%甲酸的甲醇溶液40 mL，超聲提取30 min，移入50 mL 量瓶并定容。用時搖勻，靜置，吸取上清液經(jīng)0.45 μm 的微孔濾膜濾過，備用。

1.4 色譜和質(zhì)譜條件

采用 Zorbax Eclipse XDB-C18 (2.1 mm ×150 mm, 5 μm)色譜柱，美國Agilent 公司；流動相A：水（含0.2%甲酸），B：乙腈（含0.2%甲酸）；采用線性梯度洗脫程序進(jìn)行洗脫（0 min，5% B；1.5 min， 10%B；10 ~15min，40%B），流速為0.25 mL/min；柱溫:25 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。電離源為電噴霧電離源正離子模式，采用選擇性離子監(jiān)測(0~8.8 min，m/z 355；8.8~10.0min，m/z 181； 10.0~15min m/z 195)。毛細(xì)管電噴霧電壓:4.0 kV； 霧化氣(N2): 20.9 kPa；干燥氣(N2):流速8 L/min；溫度300℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取劑的選擇

據(jù)文獻(xiàn)報道[5]，綠原酸和阿魏酸不穩(wěn)定，尤其是阿魏酸遇光、遇熱易分解。本文對比了采用50%甲醇水溶液、100%甲醇溶液和含5%甲酸的甲醇溶液對樣品進(jìn)行超聲提取，結(jié)果表明采用含5%甲酸的甲醇溶液處理樣品時提取率高，穩(wěn)定性好。

2.2 流動相的選擇

本文對常用流動相甲醇-水和乙腈-水進(jìn)行了考察，實驗結(jié)果表明，使用乙腈-水比甲醇-水作流動相時靈敏度略高。實驗中探討了將0~0.5%的甲酸溶液加入到流動相中對質(zhì)譜靈敏度和色譜分離效果的影響，發(fā)現(xiàn)隨著流動相中甲酸濃度的增大，色譜峰形對稱性好，綠原酸的離子強(qiáng)度增強(qiáng)，而阿魏酸的離子強(qiáng)度則有所減弱。最終選擇在流動相中加入0.2%甲酸的乙腈-水為流動相進(jìn)行線性梯度洗脫。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

有文獻(xiàn)報道，采用液相色譜-質(zhì)譜測定藜蒿中綠原酸[6]、測定綠原酸的水解動力學(xué)及鑒定水解產(chǎn)物[7]和測定水溶性迷迭香提取物中的阿魏酸和咖啡酸[8]時，均是在負(fù)離子模式下進(jìn)行掃描。本文分別采用了正離子模式和負(fù)離子模式進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)在本試驗條件下，采用正離子模式掃描，對3種酚酸的檢測較靈敏。由于阿魏酸遇光、遇熱易分解[5]，本文比較了常用霧化室溫度300~350℃對電離的影響，結(jié)果表明，霧化室溫度采用300℃比較適宜。在選定的色譜-質(zhì)譜條件下，被測組分間獲得較好的分離，色譜圖見圖1。根據(jù)峰的保留時間及質(zhì)譜信息進(jìn)行定性，其質(zhì)譜特征離子圖譜見圖2。從圖譜2 中，可以看出3 種酚酸的 [M+H]+峰較明顯，因此，進(jìn)行選擇性離子監(jiān)測時，我們分別對綠原酸(m/z)355；咖啡酸(m/z)181；阿魏酸 (m/z)195 的碎片離子進(jìn)行監(jiān)測。

2.4 線性關(guān)系及檢出限

分別吸取對照品儲備液適量，以含5%甲酸的甲醇溶液配制成濃度為0.050～20.0 μg/mL 的綠原酸系列溶液、濃度為0.030～20.0 μg/mL 的咖啡酸系列溶液及濃度為0.100～20.0 μg/mL 的阿魏酸系列溶液。取上述系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各5 μL 進(jìn)樣分析,記錄各色譜峰的峰面積。以各對照品的峰面積(3 次平均值)對其質(zhì)量濃度(μg/mL)進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)。以信噪比等于3 計，得到上述3 種組分的檢出限，均列于表1。

2.5 精密度試驗

準(zhǔn)確吸取含綠原酸、咖啡酸和阿魏酸均為5.00 μg/mL 的混合對照品溶液，按1.3 節(jié)所述供試品溶液的制備方法準(zhǔn)備測試液，在同一天內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣6 次，計算日內(nèi)精密度RSD。結(jié)果3 種酚酸的峰面積的RSD 分別為0.68%，0.52%，0.79%，表明方法精密度好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，室溫放置，在 10 h 內(nèi)不同時間進(jìn)樣分析，測定峰面積，3 種酚酸的峰面積的RSD 分別為2.1%，1.7%，2.6%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置10 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗

取同一批樣品6 份，按1.3 節(jié)供試品溶液的制備方法準(zhǔn)備測試液，進(jìn)行平行試驗測定。結(jié)果該批樣品的綠原酸的平均含量為0.255 mg/g, RSD 為2.5%；咖啡酸的平均含量為0.148 mg/g, RSD 為2.2%；阿魏酸的平均含量為0.101 mg/g, RSD 為2.5%。

2.8 加標(biāo)回收率試驗

精密稱取已測知含量（綠原酸 0.255 mg/g，咖啡酸0.148 mg/g, 阿魏酸0.101 mg/g）的蒲公英顆粒0.200 g 共9 份，3 份為一組，按低、中、高 3 個濃度分別加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按1.3 節(jié)供試品溶液的制備方法準(zhǔn)備測試液并進(jìn)行分析，分別計算3 種成分的平均回收率，結(jié)果見表 2。

2.9 樣品測定

分別精密稱取不同批號樣品，按1.3 節(jié)供試品溶液的制備方法準(zhǔn)備測試液并進(jìn)行測定，每批樣品進(jìn)樣6 次，根據(jù)外標(biāo)法計算3 批蒲公英顆粒中的綠原酸、咖啡酸和阿魏酸含量。結(jié)果是，綠原酸含量分別為0.255 mg/g，0.248 mg/g 和0.267 mg/g ；RSD 分別為2.5%，3.4%和4.1% �？Х人岷�量分別為 0.148mg/g ，0.156 mg/g 和0.179 mg/g；RSD 分別為2.2%，2.6%和 3.1%。阿魏酸含量分別為 0.101 mg/g， 0.0981 mg/g 和0.116 mg/g；RSD 分別為2.2%，2.6%和3.1%。

3 結(jié)論

本文建立的液相色譜-質(zhì)譜同時測定綠原酸、咖啡酸和阿魏酸含量的分析方法，準(zhǔn)確、快速且重復(fù)性好，可以用于蒲公英及其制劑的質(zhì)量控制。

參考文獻(xiàn)

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