綠原酸的微波超聲波聯(lián)合提取及其抑菌作用 | 綠原酸的微波超聲波聯(lián)合提取及其抑菌作用 |
| 發(fā)布時間:2011-01-04 信息來源:admin 發(fā)布人:admin 點擊次數(shù):4090 |
綠原酸的微波超聲波聯(lián)合提取及其抑菌作用
摘 要：為了尋找更高效的綠原酸提取方法及進一步明確綠原酸的抑菌活性及抗菌譜，本文以金銀花為材料，通過對稀醇回流法、超聲波提取法、微波輔助提取法等方法的考察發(fā)現(xiàn)微波-超聲波聯(lián)合提取法的綠原酸提取率最高；正交實驗得出其最佳工藝參數(shù)為：在250 W功率下微波預(yù)處理3次，30 s/次；再按料液比（v/v,1/20）加入70 %乙醇，在功率18 W下超聲提取20 min，一次性提取率即達73%以上；各因素的影響大小分別為：超聲功率＞溶劑倍量＞超聲時間。抑菌研究表明，綠原酸對革蘭氏陰性菌的抑菌活性比革蘭氏陽性菌更強，綠原酸水溶液對志賀氏菌、沙門氏菌的最小抑菌濃度均為0.125 mg/ml，抑菌效果與0.1 mg/ml的卡那霉素的抑菌效果相當。
關(guān)鍵詞：金銀花；綠原酸；微波-超聲波聯(lián)合提取；抑菌活性 上禾生物 staherb
1. 引言 金銀花（houneysuckle flowers）為忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb）的干燥花蕾或初開的花。金銀花的特征活性成分為綠原酸,具有抗菌、抗病毒、升高白細胞、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血壓、降血脂等作用。Hideko M 等的研究結(jié)果認為, 綠原酸是很有希望的抗艾滋病毒(HIV)的先導(dǎo)化合物。鑒于綠原酸的巨大開發(fā)價值，國內(nèi)外已紛紛開展綠原酸提取及其藥理活性的相關(guān)研究，綠原酸的提取工藝也取得了一定的研究進展，但提取率低、能耗大、耗時長、工藝復(fù)雜等問題一直未能有效解決。微波、超聲波提取作為新型的提取技術(shù),具有被提取活性物質(zhì)不被破壞,提取時間短等優(yōu)點，在天然產(chǎn)物提取方面已得到廣泛的應(yīng)用,然而目前只有少量應(yīng)用微波、超聲波提取技術(shù)提取綠原酸的報道，且尚無將微波-超聲波聯(lián)用提取金銀花中綠原酸的報道。目前雖已有一些關(guān)于綠原酸抑菌活性作用的研究報道，但綠原酸的抑菌作用機理及其抗菌譜尚不明了，尚無綠原酸關(guān)于志賀氏菌、沙門氏菌、李斯特菌等幾種常見致病菌的抑菌活性報道，為此，本文以重慶金銀花為原料，以綠原酸提取率為指標，采用UV光譜法、HPLC法定性定量分析方法，通過對70%乙醇回流提取法、超聲波提取法、微波輔助提取法與微波-超聲波聯(lián)用法進行比較研究；并研究了綠原酸對志賀氏菌、沙門氏菌、李斯特菌的抑菌活性，以期優(yōu)化綠原酸的提取工藝，明確綠原酸抗菌譜提供參考。 2. 材料與方法 2.1 材料、試劑與儀器 金銀花取自重慶市秀山縣，沙門氏菌、志賀氏菌、李斯特菌、金黃色葡萄球菌菌株為實驗室保存。主要試劑：無水甲醇，冰乙酸為色譜純；無水乙醇等購自重慶化學試劑公司，均為化學純；綠原酸標準品購自Sigma公司。 主要實驗儀器：超聲波發(fā)生器（SONICS＆MATERIALS，美國）；微波爐（格蘭仕，中 國）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（BUCHI，瑞士）；紫外成相系統(tǒng)（Bio-Rad，美國）；紫外可見光分光光 度儀（島津UV-2450，日本）；HPLC儀（島津10AVP-10AT,日本）。 2.2 提取工藝： 2.2.1 稀醇回流法精密稱取金銀花粉末10 g，用70%乙醇按料液比1:8混合，在pH值3.0下60℃恒溫振蕩回流提取2次，2 h/次。將樣品液真空減壓抽濾，加水沉淀蛋白鞣質(zhì)等雜質(zhì)，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至原體積1/4~1/5，低溫冷藏備用。 2.2.2 超聲波提取法（UE） 用70 %乙醇溶液將金銀花干粉10 g 按液料比1:5 (v/v)預(yù)浸過夜，按料液比（v/v,1:8）加入70%乙醇溶液，調(diào)pH 3.0，超聲（20 Hz）提取兩次，30 min /次，下同2.2.1。 2.2.3 微波輔助提取法（ME 法） 用70%乙醇溶液將金銀花干粉10 g 按液料比(1/5, v/v)預(yù)浸過夜，微波（250 W）打3 次，30 s/次；再按料液比（1/8, v/v）加入70%乙醇溶液調(diào)pH 3.0，60℃水浴回流提取兩次，30 min/次，下同2.2.1。 2.2.4 微波-超聲波聯(lián)合提取法（MUE 法） 用70 %乙醇溶液將金銀花干粉10g 按液料比（v/v,1:5）預(yù)浸過夜，在微波功率250 W 條件下預(yù)處理3 次，30 s/次；加入70%乙醇溶液按料液比（v/v,1:8），調(diào)pH 3.0，超聲（20 Hz）提取兩次，30 min /次，反應(yīng)溫度為常溫，下同2.2.1。 2.3 MUE 法正交實驗優(yōu)化 選用L（23）因素水平表對MUE 法進行正交實驗優(yōu)化，見表1。
2.4 紫外光譜法（UV）分析 配制綠原酸（上禾生物）標準品溶液，用UV-2450 型紫外可見光分光光度計在200~400 nm 波長范圍內(nèi)掃峰，確定綠原酸標準品的最大吸收波長；再用50%的甲醇溶液將綠原酸標準品精密配制成0.2，0.5，0.75，1.0，1.25，1.5 μg/ml 6 個濃度的溶液，在最大吸收波長下測定其吸光值（A）。以濃度C（x 軸）對濃度吸光度A (y 軸)作圖繪制UV 標準曲線，得到標準曲線回歸方程。同法定溶各方法提取物及純化物，制成待測樣品，測定吸光值，通過標準曲線回歸方程計算各終產(chǎn)物中綠原酸含量。 2.5 高效液相色譜（HPLC）分析 采用外標法對待測樣品進行定性分析。色譜柱: ZOBAX SB(150 mm×4.6 mm,5 μm) ；流動相：甲醇:超純水:冰乙酸(18:81:1,v/v)；流速:1 mL·min- 1；檢測波長: 紫外掃描的最大吸收波長；柱溫:30 ℃；進樣量:20 μL。用50 %的甲醇溶液將綠原酸（上禾生物）標準品溶液精密配制成0.1，0.3，0.5，0.7，1.0，1.3 μg/ml 6 個濃度的溶液進樣檢測。以濃度C（x 軸）對峰面積V(y 軸)作圖，得到標準曲線回歸方程。同法定溶各方法提取物及純化物，制成待測樣品，進樣測定峰面積，通過標準曲線回歸方程計算各終產(chǎn)物中綠原酸含量。 2.6 抑菌實驗 采用超凈工作臺無菌操作；取10 ml 瓊脂培養(yǎng)基于直徑為9 cm 的無菌培養(yǎng)皿中，鋪勻，凝固后，取50 μl含有活菌數(shù)為106～108/ml的菌液均勻涂布到培養(yǎng)皿中，放入直徑為5 mm的濾紙片；分別在濾紙片上滴加20 μl用純水配置的（1 mg/ml，0.5 mg/ml，0.25 mg/ml，0.125mg/ml，0.0625 mg/ml ）5個濃度梯度的綠原酸提取物及其純品溶液；以濃度為0.1 mg/ml的卡那霉素作陽性對照，用超純水作空白對照；37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h后，觀察抑菌圈的大小和透明度，恰好沒有抑菌圈出現(xiàn)的培養(yǎng)皿所用的溶液濃度為最小抑菌濃度(MIC)。三次重復(fù)。 3. 結(jié)果與分析 3.1 金銀花提取物的鑒定 3.1.1 金銀花提取物的UV 鑒定 通過UV 掃描測定綠原酸（上禾生物）標準品的最大吸收波長約為327nm（圖1），故確定該波長為UV 及HPLC 檢測波長。提取終產(chǎn)物出現(xiàn)最大吸收峰的波長及峰形均與標準品一致，因此，可初步認為該終產(chǎn)物含綠原酸（見圖2，3）。
3.1.2 金銀花提取物的HPLC 測定 經(jīng)實驗優(yōu)化，HPLC 分析參數(shù)為：色譜柱ZOBAX SB( 150 mm ×4. 6mm, 5μm) ；流動相為甲醇:水:乙酸(18:81:1,v/v) ;流速:1 mL·min- 1 ;檢測波長:327 nm;柱溫:30 ℃;進樣量:20 μL。在此條件下,樣品中綠原酸與相鄰成分達到基線分離（見圖3）。根據(jù)綠原酸標準品的HPLC 檢測結(jié)果，以濃度C（x 軸）對峰面積V（y 軸）作圖，得到標準曲線回歸方程為：y = 52446 x-2573，R=0.9931；在1～13 μg/ml 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。采用外標法對提取的綠原酸進行確認，在保留時間8.832 min 檢測到的物質(zhì)為綠原酸；同法測得金銀花生藥綠原酸含量為3.3 %（n=5，RSD=2.0 %），回收率98 %。
3.2 4 種提取方法對綠原酸含量的影響 由HPLC 法測定各提取法終產(chǎn)物中綠原酸的含量，結(jié)果見表2。
由表2 可以看出，用MUE 法提取綠原酸的提取率與70 %乙醇回流法相當，高于單獨的超聲法和微波輔助提取法；采用MUE 法提取的提取物中綠原酸含量最高，由圖3 可見MUE 法粗提物有1 個雜峰；而回流法提取物中雜質(zhì)含量較高，其HPLC 圖譜有4 個雜峰。綜合考慮以上因素，各提取法中MUE 法提取物中綠原酸含量最高引入雜質(zhì)最少，反應(yīng)條件較回流法溫和且耗時更短，常溫短時間提取即可達到與回流法相當?shù)木G原酸提取率。 由圖4 可以看出，采用MUE 法提取效率高，在第1、2 次提取后其提取率已經(jīng)達到80 %以上；由圖5 可以看出相同溶劑量情況下2 次提取較1 次提取的提取率提高了20 %以上，但2 次提取缺點是增加了操作步驟，可以考慮適當加大溶劑量一次提取；另外，微
注：圖5 中1,2 為14 倍劑量一次提��；3, 4 為兩次提取（v/v,1/8,1/6）；1，3 為預(yù)浸1 h；2，4 為預(yù)浸2 h 波破壁前預(yù)浸2 h 較1 h 提取效率高了5 %以上，由此結(jié)合微波的工作原理可以推斷預(yù)浸過程中預(yù)浸2 h 較1 h 水分進入樣品更充分，更利于微波發(fā)揮作用。綜合考慮提取時間，提取流程復(fù)雜程度，實際經(jīng)濟價值等因素，最終確定將原料預(yù)浸過夜（不耽誤正常工作時間），一次性提取作為MUE 法正交實驗的參數(shù)。 3.3 MUE 法提取條件優(yōu)化 為了優(yōu)化MUE 法的提取條件，本研究采用了L（23）正交實驗，結(jié)果見表3。
由表3（方差分析表略）結(jié)果得出最佳工藝為A2B2C1，即20 倍量，18 W，20 min。各因素的影響大小順序為B＞A＞C，即超聲功率＞溶劑倍量＞超聲時間。在此條件下一次提取率既可以達到73.63 %，明顯優(yōu)于傳統(tǒng)提取法。 3.4 綠原酸提取物抑菌活性 比較綠原酸標準品和金銀花中綠原酸提取純化物對四種菌的抑制效果后發(fā)現(xiàn)二者抑菌效果相當（圖8，圖9），抑菌圈直徑從大到小分別為：志賀菌、沙門菌、李斯特菌、金葡菌；對志賀菌、沙門菌的MIC 均為0.125 mg/ml，對金葡菌的MIC 為1 mg/ml，對李斯特菌的MIC 為0.5 mg/ml（表4）。
綠原酸標品（圖中A）、金銀花綠原酸提取物（圖中B）、卡那霉素（圖中C）的抑菌活性對比見圖6，圖7。由圖可以看出綠原酸標品（1 mg/ml）和金銀花中綠原酸提取物（1 mg/ml）對志賀菌、沙門菌二種菌的抑制效果一致，且與卡那霉素0.1 mg/ml 所產(chǎn)生的抑菌效果相當。
4. 結(jié)論 本文經(jīng)提取方法對比，MUE法提取率顯著高于單獨采用ME法或UE法。王宏軍[13]等人采用超聲波-索氏聯(lián)合提取法（U+S法）提取終產(chǎn)物中綠原酸含量也顯著高于U法和S法，而MUE法的提取時間較U+S法大大縮短，且提取效率更高，估計是在微波短時多次破壁和超聲波破壁雙重作用下細胞破壁更徹底，更加利于綠原酸溶出，且在溫和提取條件下綠原酸結(jié)構(gòu)得到了更好的保護；正交實驗結(jié)果顯示，超聲功率對提取率影響最顯著，說明有必要進一步研究超聲功率與細胞破壁及提取率關(guān)系；綜合考慮上述因素可以推測，提高細胞破壁效率及保護綠原酸結(jié)構(gòu)是提高綠原酸提取率的關(guān)鍵，有必要在這一方面做更深入和全面的研究。 在綠原酸含量的檢測中，紫外分光光度法所測結(jié)果與高效液相法所測結(jié)果相比偏差較大，但趨勢相同,這與烏蘭[14]等人的研究結(jié)果一致，故綠原酸的定量應(yīng)采用HPLC 法為好；但將紫外分光光度法用于前期的提取工藝比較篩選既有效也可以節(jié)約實驗時間和成本。 本文在抑菌實驗中采用濾紙片代替牛津杯[14]也取得了滿意的效果，且簡單易操作。綠原酸標品和金銀花中綠原酸提取物對志賀菌、沙門菌的抑菌效果較對李斯特菌和金葡菌強；對這兩種菌的MIC與卡那霉素的常用抑菌MIC（0.1 mg/ml）相當；對金葡菌的MIC 為1 mg/ml與張紅峰等[19]報道的MIC（0.8 mg/ml）基本一致，其原因可能是使用方法的差異。志賀菌、沙門菌均為革蘭氏陰性菌，李斯特菌和金葡菌均為革蘭氏陽性菌，推測綠原酸對革蘭氏陰性菌的抑制活性可能更強。在致病菌對對抗生素耐藥性普遍增強的今天，將綠原酸作為代替抗生素的抑菌活性成分具有很好的開發(fā)價值。
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產(chǎn)品鏈接：
杜仲提取物 綠原酸 金銀花提取物 苦杏仁苷 枇杷葉提取物-熊果酸 大花紫薇提取物-科羅索酸
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