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石少瀾2 , 王祝舉1 , 邵愛娟1 ,黃璐琦1

(1 中國(guó)中醫(yī)研究院中藥研究所, 北京100700 ; 21 河北農(nóng)業(yè)大學(xué), 河北保定071001)

　杜仲為杜仲科杜仲屬植物Eucommia ulmoides Oliv1 ,是我國(guó)特有的經(jīng)濟(jì)樹種,國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物。傳統(tǒng)以皮入藥,味甘、性溫,歸肝、腎經(jīng),具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、安胎的功效[1 ] ,是一種名貴滋補(bǔ)藥材,也是我國(guó)傳統(tǒng)的出口創(chuàng)匯商品之一。杜仲皮含有木脂素類、環(huán)烯醚萜類、苯丙素類、多糖等多種活性成分[2 ] 。綠原酸屬苯丙素類化合物,具有抗菌消炎作用[3 ] ,是杜仲皮中主要有效成分之一。為了考察其與產(chǎn)地、年齡、樹皮變異類型(光皮型、淺裂型、深裂型) 之間的關(guān)系,本研究建立了反相高效液相色譜法,對(duì)不同產(chǎn)地、不同樹齡、不同變異類型、炮制與非炮制等杜仲皮中的綠原酸含量進(jìn)行分析,為藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了依據(jù)。

1           儀器與試劑

Waters Alliance 高效液相色譜儀(Waters 600 con2 troller ,Waters 2487 單波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器,Millennium32色譜工作站) ; BIS210S 型1/ 1 萬電子分析天平(德國(guó)sartorius 公司) ;CX2250 超聲波清洗器(北京醫(yī)療設(shè)備二廠) 。甲醇、乙腈為一級(jí)色譜醇;醋酸為優(yōu)級(jí)純;綠原酸對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)為532200111 ;實(shí)驗(yàn)藥材分別購(gòu)自四川成都、湖北鄖西黑山林場(chǎng)、湖北巴東三峽林場(chǎng)、湖南慈利江埡林場(chǎng)、陜西略陽(yáng)金家河林場(chǎng)等,經(jīng)中國(guó)中醫(yī)研究院中藥研究所黃璐琦研究員鑒定為杜仲科植物杜仲E1 ulmoides 的樹皮。

2 　方法與結(jié)果

2.1 　色譜條件　Kromasil2C18色譜柱(416 mm ×250mm ,510μm) ;流動(dòng)相甲醇2乙腈2冰醋酸2水(4∶3∶2∶91) ;檢測(cè)波長(zhǎng)325 nm;流速110 mL·min - 1 。柱溫25℃。在該色譜條件下,樣品中綠原酸峰與其他非被測(cè)成分峰能夠達(dá)到基線分離,對(duì)照品與樣品的色譜圖見圖1。

2.2 　對(duì)照品溶液的制備　精密稱取綠原酸對(duì)照品1.25 mg ,置于10 mL 量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,即得0.125 mg·mL - 1的貯備液,準(zhǔn)確吸取2.5mL 的貯備液置另一10 mL 量瓶中,再用甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得含綠原酸010312 mg·mL - 1的對(duì)照品溶液。

2.3 　供試品溶液的制備　取干燥的杜仲樹皮,用碾碎機(jī)碾成絮狀,混合均勻。精密稱定1 g ,置100 mL錐形瓶中,準(zhǔn)確加入50 %甲醇50 mL ,稱重后超聲提取60 min ,取出,放至室溫后再稱重,補(bǔ)足揮發(fā)的溶劑重量,搖勻,過濾,取續(xù)濾液25 mL ,50 ℃以下減壓蒸干,用甲醇溶解,定容到5 mL 量瓶中,用微孔濾膜過濾即為供試品溶液。

2.4 　線性關(guān)系考察　分別精密吸取01031 2 mg·mL - 1的對(duì)照品溶液1 ,3 ,5 ,7 ,9 ,11 ,13 ,15μL ,在所選擇的色譜條件下進(jìn)樣分析。以進(jìn)樣量(μg) 為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為Y= 21788 6 ×106 X + 19 039 , r = 01999 8。結(jié)果綠原酸在0.031 2～0.468 8μg 線性關(guān)系良好。

2.5 　穩(wěn)定性試驗(yàn)　對(duì)同一供試品溶液分別于制備后0 ,2 ,8 ,24 ,48 h 測(cè)定綠原酸峰面積。結(jié)果RSD1.2 % ,表明樣品在48 h 內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.6 　精密度試驗(yàn)　精密吸取對(duì)照品溶液10μL ,連續(xù)進(jìn)樣5 次,測(cè)定峰面積值,RSD 0.16 %。

2.7 　重復(fù)性實(shí)驗(yàn)　準(zhǔn)確稱取同一樣品共5 份,每份1 g ,照“供試品溶液制備”項(xiàng)下操作,測(cè)定,測(cè)得其平均含量為0.013 % ,RSD 1.1 % ,表明方法重復(fù)性良好。

2.8 　加樣回收率試驗(yàn)　精密稱取已知含量的樣品5 份,每份1 g ,加對(duì)照品適量,按“供試品溶液制備”項(xiàng)下操作,測(cè)定,計(jì)算回收率,結(jié)果見表1。

2.9 　樣品含量測(cè)定　根據(jù)上述條件對(duì)14 份樣品進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果見表2。綠原酸的含量隨樹皮類型的不同有較大差異。其中光皮型含量最高,淺裂型次之,深裂型最低。光皮型與深裂型能相差幾十倍。而與樹齡、地域關(guān)系不大。炮制后的杜仲皮仍含有綠原酸。枝皮中的綠原酸含量很低。

3 　討論

3.1 　實(shí)驗(yàn)采用HPLC 測(cè)定杜仲樹皮中綠原酸的含量,結(jié)果準(zhǔn)確,精密度,重復(fù)性好,平均加樣回收率為97.4 % ,RSD 3.0 %。

3.2 　對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了比較,曾用了不同比例的甲醇-水,甲醇-醋酸-水,甲醇-異丙醇-醋酸-水,乙腈-醋酸-水,甲醇-乙腈-醋酸-水等系統(tǒng),結(jié)果以甲醇-乙腈-冰醋酸-水(4∶3∶2∶91) 條件較好,保留時(shí)間適中,綠原酸能與非被測(cè)成分基線分離。

3.3 　對(duì)提取方法進(jìn)行考察時(shí),比較了甲醇的含量及提取時(shí)間。以水、20 %甲醇、50 %甲醇、80 %甲醇、甲醇為溶劑,超聲提取60 min ,結(jié)果以50 %甲醇為溶劑時(shí),色譜峰分離效果最佳,而且提取完全; 比較15 ,30 ,45 ,60 ,90 min 的超聲提取效果,結(jié)果60 min可提取完全。

[參考文獻(xiàn)]

[1 ] 　中國(guó)藥典1 一部1 20001 1311

[2 ] 　國(guó)家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會(huì)1 中華本草1 上冊(cè)1 上海:上�？茖W(xué)技術(shù)出版社, 19961 2861

[3 ] 　杜紅巖1 杜仲活性成分與藥理研究的新進(jìn)展1 經(jīng)濟(jì)林研究,2003 , 21 (2) :581

[4 ] 　王嗣岑,賀浪沖,高錦明,等1 RP2HPLC 法同時(shí)分離測(cè)定杜仲葉中3 種有效成分1 西北藥學(xué)雜志, 2001 , 16 (1) :151

[5 ] 　董娟娥, 馬柏林, 劉　麗, 等1 超聲波提取杜仲葉中有效成分工藝研究1 西北林學(xué)院學(xué)報(bào), 2003 , 18 (3) :661

[6 ] 　張康健, 王　藍(lán), 張鳳云, 等1 杜仲葉與皮有效成分含量的比較研究1 西北林學(xué)院學(xué)報(bào), 1996 , 11 (2) :421

[7 ] 　熊佐章1 HPLC 法測(cè)定銀翹解毒顆粒中綠原酸的含量1 中國(guó)藥師, 2003 ,6 (10) :6361