厚樸超臨界CO2提取工藝優(yōu)化及提取物抗氧化活性研究 | 厚樸超臨界CO2提取工藝優(yōu)化及提取物抗氧化活性研究 |
| 發(fā)布時(shí)間:2021-05-05 信息來源:admin 發(fā)布人:admin 點(diǎn)擊次數(shù):735 |
優(yōu)選超臨界CO2提取厚樸有效成分的工藝并探討厚樸超臨界CO2提取物的抗氧化活性。方法 采用HPLC法測(cè)定厚樸超臨界CO2提取物中厚樸酚與和厚樸酚的含量，正交試驗(yàn)優(yōu)選厚樸超臨界CO2提取工藝，MTT法檢測(cè)提取物抗氧化活性。結(jié)果 厚樸酚優(yōu)化工藝為萃取壓力25MPa，萃取溫度55 ℃，CO2用量30 kg；和厚樸酚最佳提取工藝壓力15 MPa、萃取溫度50 ℃、CO2用量25 kg。厚樸超臨界CO2提取物具有抗氧化活性，且分離參數(shù)不同，抗氧化活性有顯著差異。結(jié)論 在所優(yōu)選的提取工藝條件下，厚樸酚、和厚樸酚的提取效率較高，重復(fù)性較好，工藝穩(wěn)定可行，提取物具有良好的抗氧化活性。 厚樸首見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為木蘭科木蘭屬植物厚樸Magnolia officinalis Rehd. et Wils.或凹葉厚樸M. officinalis Rehd. et Wils. var. bilobaRehd. et Wils. 的干燥干皮、根皮及枝皮[1]，主要分布在我國(guó)長(zhǎng)江流域[2]，為國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物，是我國(guó)特有的、常見的大宗中藥材[3]。厚樸性溫，味苦、辛，入脾、胃、肺、大腸經(jīng)，具有燥濕消痰、下氣除滿的功能[4]，用于濕阻脾胃、脘腹脹滿、氣滯胸腹脹痛、便秘腹脹、痰多咳嗽等癥[5]�，F(xiàn)代研究表明，厚樸的化學(xué)成分主要有木脂素類、揮發(fā)油類、生物堿類[6]，木脂素類成分是厚樸中最豐富的一類化學(xué)成分[7]，迄今已分離出厚樸酚、和厚樸酚、和厚樸新酚、6′-O-甲基和厚樸酚等20多種化合物[8]，其主要有效活性成分為厚樸酚及和厚樸酚，厚樸酚具有抗炎、抗菌、抗哮喘、抗?jié)�、抗氧化、抗腫瘤、激素調(diào)節(jié)等藥理作用[9-12]，還可用于糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、胃腸道疾病的治療；和厚樸酚具有抗白內(nèi)障、抗血管新生、抗腫瘤、抗驚厥、抗癲癇、神經(jīng)保護(hù)、抗菌等作用[10-11]，也可用于心血管疾病及糖尿病的治療。 厚樸的常規(guī)提取方法多采用乙醇回流提取、堿提、超聲輔助提取等[13-14]。隨著提取技術(shù)的創(chuàng)新與發(fā)展，超臨界流體萃取作為一種新型分離技術(shù)，其具有高效且選擇性好[15-17]、較低溫度下提取對(duì)熱敏性物料影響小、對(duì)易氧化成分的影響小[18]等一系列優(yōu)點(diǎn)，特別對(duì)于含氧化合物、生物堿等成分提取分離效果好[19]，可在很大程度上避免傳統(tǒng)提取工藝效率低、有機(jī)溶劑殘留、資源浪費(fèi)等缺陷。已有研究表明超臨界流體萃取厚樸成分的效率是傳統(tǒng)醇回流法的數(shù)倍之多[20]。同時(shí)厚樸酚與和厚樸酚二者互為異構(gòu)體，均為脂溶性成分，適合采用超臨界CO2萃取，本實(shí)驗(yàn)嘗試優(yōu)化厚樸超臨界CO2提取工藝，并探討其提取物的體外抗氧化活性，以期為厚樸資源的合理利用奠定基礎(chǔ)。 1 儀器與試藥 1.1 儀器 HL-CQE3L/50MPa-IIC型超臨界CO2萃取裝置，杭州華黎泵業(yè)有限公司；2200型中藥材粉碎機(jī)，常州五谷農(nóng)場(chǎng)食品有限公司；SPD-16高效液相色譜儀，紫外-可見檢測(cè)器，島津儀器有限公司；UV-9100型紫外分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器公司；SB-5200 DTD超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；New Classic MF天平，Mettler Toledo公司；DGF-4AB型立式電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；EKUP-II-20T型超純水系統(tǒng)，長(zhǎng)沙市科臨電子科技有限公司；SHEL-LAB CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)Sheldon Manufacturing公司；Varioskan Flash酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，美國(guó)Thermo Scientific公司；Microfuge 20R高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Beckman Coulter公司。 1.2 試藥 厚樸飲片購(gòu)自湖南福泰中藥飲片有限公司，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)劉塔斯教授鑒定為木蘭科木蘭屬植物凹葉厚樸Magnolia officinalis Rehd. etWils. var. biloba Rehd. et Wils.(MOB) 的干燥干皮、根皮及 枝皮。對(duì)照品厚樸酚（批號(hào)KS0912CB14）、和厚樸酚（批號(hào)28O6B5149），質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%，上海源葉生物科技有限公司；MTT，批號(hào)M2128，美國(guó)Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)基，AB216498，美國(guó)Hyclone公司；30%的過氧化氫溶液，批號(hào)F1825154，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二甲基亞砜為分析純；甲醇為進(jìn)口色譜純，Tedia公司；蒸餾水為二次重蒸餾水；其他試劑均為分析純。 2 方法與結(jié)果 2.1 色譜條件 色譜柱為Diamonsil® C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-水（70∶30）；檢測(cè)波長(zhǎng)294 nm；柱溫30 ℃；體積流量1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；在此色譜條件下，厚樸酚、和厚樸酚分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按厚樸酚峰計(jì)算不低于3 800。 2.2 對(duì)照品及供試品溶液的制備 2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取厚樸酚對(duì)照品2.01 mg、和厚樸酚對(duì)照品2.32 mg，分別置于25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成含厚樸酚80.40 μg/mL與和厚樸酚92.80 μg/mL混合對(duì)照品溶液。 2.2.2 供試品溶液的制備 厚樸飲片粉碎，過40目篩，置于60 ℃的烘箱中烘干后裝入料筒，置入超臨界CO2萃取裝置進(jìn)行提取，收集分離釜1和2的提取物并均勻混合，精密稱取提取物適量，置于25 mL量瓶中，加甲醇使之溶解并稀釋至刻度，超聲5 min，靜置，過0.45 μm的微孔濾膜，即得供試品溶液。 2.3 HPLC分析方法學(xué)考察 2.3.1 色譜條件的選擇 分別采用甲醇-水的不同配比（78∶22、70∶30、65∶35）進(jìn)行篩選，在甲醇-水（70∶30）的流動(dòng)相比例下目標(biāo)峰不受其他雜質(zhì)峰的干擾，峰形對(duì)稱。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定厚樸酚對(duì)照品的吸光度，確定檢測(cè)波長(zhǎng)294 nm。在上述色譜條件下，和厚樸酚、厚樸酚分離良好，保留時(shí)間分別為8.4、11.2 min。色譜圖見圖1。 圖片 2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密吸取厚樸酚與和厚樸酚對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL置于5 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，制成不同質(zhì)量濃度梯度的系列對(duì)照品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣10 μL測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，厚樸酚的線性回歸方程分別為Y＝12 554.8 X＋30 696.6，r＝0.999 3；和厚樸酚為Y＝16 703.9 X＋70 459.8，r＝0.999 1；結(jié)果表明，厚樸酚與和厚樸酚進(jìn)樣質(zhì)量濃度分別在8.04～80.4 μg/mL和9.28～92.8 μg/mL與峰面積呈良好的線性關(guān)系。 2.3.3 精密度試驗(yàn) 分別取厚樸酚、和厚樸酚對(duì)照品溶液各10 μL，依法連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果厚樸酚與和厚樸酚峰面積的RSD分別為2.41%和1.86%，表明儀器精密度良好。 2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取厚樸飲片按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行配制6份，進(jìn)樣測(cè)定樣品中厚樸酚與和厚樸酚的含量，結(jié)果表明厚樸酚與和厚樸酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為2.62%、2.78%，說明所建立的分析方法重復(fù)性較好。 2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.3.4”項(xiàng)重復(fù)性試驗(yàn)1號(hào)供試品溶液，分別于0、2、4、6、12、24 h時(shí)測(cè)定峰面積。結(jié)果厚樸酚、和厚樸酚峰面積的RSD分別為1.63%和2.13%，表明所配制的供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。 2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取6份已測(cè)定厚樸酚與和厚樸酚含量的厚樸粗提取物，置于5 mL量瓶中，每份精密加入取厚樸酚與和厚樸酚對(duì)照品溶液各1 mL，加甲醇至近刻度線，搖勻，超聲30 min，放冷后定容至刻度線，微孔濾膜濾過。按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，分別計(jì)算加樣回收率，結(jié)果厚樸酚與和厚樸酚的平均加樣回收率分別為99.15%、99.07%，RSD分別為2.06%、3.10%。 2.4 正交試驗(yàn) 2.4.1 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析 超臨界流體萃取過程受多種因素影響，如萃取目標(biāo)成分本身性質(zhì)、超臨界流體的狀態(tài)、溶劑用量、提取時(shí)間等。作為連續(xù)流加溶劑的萃取過程，超臨界CO2萃取過程溫度低且在CO2保護(hù)下進(jìn)行，可有效降低目標(biāo)組分的氧化破壞和組分之間的化學(xué)反應(yīng)，而提取過程中提取時(shí)間受CO2體積流量的影響很大，但因萃取過程中CO2的狀態(tài)不斷改變，故提取過程中CO2體積流量并不穩(wěn)定，因此以CO2用量作為一個(gè)考察因素。根據(jù)前期試驗(yàn)初步篩選結(jié)果選擇萃取壓力（A）、萃取溫度（B）、CO2用量（C）3因素，選用L9(34)因素水平表進(jìn)行正交試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)號(hào)平行2次，取平均值。以厚樸粗提取率（Y1，Y1＝提取物質(zhì)量/厚樸量）、厚樸酚提取量（Y2，Y2＝提取物中厚樸酚質(zhì)量/厚樸量）、和厚樸酚提取量（Y3，Y3＝提取物中和厚樸酚質(zhì)量/厚樸量）、厚樸酚與和厚樸酚總提取量（Y4，Y4＝Y(jié)2＋Y3）為評(píng)價(jià)指標(biāo)。因素水平及正交試驗(yàn)結(jié)果見表1，極差分析結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。 圖片 由表2、3結(jié)果可知，對(duì)于厚樸粗提取率及以厚樸酚提取量為優(yōu)化目標(biāo)的優(yōu)化工藝均為A3B3C2，即萃取壓力25 MPa，萃取溫度55 ℃，CO2用量30 kg，其中壓力對(duì)其影響最大，溫度影響最小。壓力越大，超臨界流體的密度越大，則溶解能力越強(qiáng)，溫度越高，超臨界流體的黏度降低，則擴(kuò)散能力越強(qiáng)，這符合超臨界CO2萃取的基本規(guī)律，但考慮到生產(chǎn)成本、工業(yè)化生產(chǎn)的實(shí)施以及對(duì)藥材中熱敏性物料的保護(hù)等問題，未繼續(xù)考察進(jìn)一步升高壓力和溫度所帶來的影響，以A3B3C2為優(yōu)化提取工藝。 對(duì)于以單位質(zhì)量生藥材的和厚樸酚提取量為優(yōu)化目標(biāo)所獲得的優(yōu)化工藝為A1B2C1，即萃取壓力15 MPa，萃取溫度50 ℃，CO2用量25 kg，其中CO2用量對(duì)其影響最大，壓力影響最小。此外，對(duì)于厚樸酚與和厚樸酚總提取量為指標(biāo)的最終優(yōu)化工藝亦同厚樸酚提取優(yōu)化工藝，這源于提取物中厚樸酚的含量要比和厚樸酚大近1倍，這也符合文獻(xiàn)報(bào)道[21]的超臨界CO2萃取厚樸提取物中的成分分布， 因此，提取物中以厚樸酚為主導(dǎo)，體現(xiàn)出與厚樸酚相同的提取工藝參數(shù)。 2.4.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 分別以厚樸酚與和厚樸酚最優(yōu)提取工藝為條件，以厚樸酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)與和厚樸酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，厚樸酚：萃取壓力控制在25 MPa，萃取溫度為55 ℃，CO2用量是30 kg；和厚樸酚：萃取壓力控制在15 MPa，萃取溫度為50 ℃，CO2用量是25 kg。分別進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，測(cè)定厚樸酚與和厚樸酚含量，計(jì)算出厚樸提取物中厚樸酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為38.21%、39.56%、40.04%，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為39.37%，RSD為2.57%；和厚樸酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為12.28%、12.71%、12.30%，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.43%，RSD為2.0%。結(jié)果表明，在優(yōu)選出的提取工藝條件下，厚樸酚、和厚樸酚的提取效率較高，重復(fù)性較好，工藝穩(wěn)定可行。 2.5 MTT法檢測(cè)抗氧化活性 將人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y細(xì)胞按8×103個(gè)/孔接種于96孔板，置于RPMI1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素100 kU/L）中，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分空白對(duì)照組、正常對(duì)照組、H2O2干預(yù)（模型）組以及6組藥物組，每組設(shè)5個(gè)平行復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，空白組與模型組加等量培養(yǎng)基，各給藥組加相應(yīng)濃度的含藥培養(yǎng)基預(yù)先干預(yù)2h后，模型組與藥物組加入400μmol/L的H2O2誘導(dǎo)2 h后，每孔加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出96孔板，PBS沖洗3遍，加入DMSO，搖床上低速振蕩10 min，采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定490 nm處的吸光度（A）值[22]。為揭示不同分離條件下厚樸提取物的抗氧化活性差異，分離釜1以10 MPa、40 ℃分離得樣品1，分離釜2以5 MPa、35 ℃分離得樣品2，分別用DMSO將樣品1和樣品2制成0.125、0.25、0.75、1、2、5 mg/mL 6個(gè)不同質(zhì)量濃度梯度的厚樸提取物溶液，分別進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，測(cè)定490 nm處的A值，計(jì)算厚樸超臨界CO2提取物對(duì)H2O2致SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷的抑制率，結(jié)果見圖2。 抑制率＝(A模型－A藥物)/(A模型－A空白) 圖片 由圖2可知，樣品1和2對(duì)H2O2致SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷的抑制率存在明顯差別，說明超臨界流體萃取過程中不同的分離壓力和溫度獲得的產(chǎn)物有效成分存在明顯差別，樣品1獲得的厚樸提取物隨著質(zhì)量濃度上升，其抑制率升高，0.25 mg/mL時(shí)最大，達(dá)85.80%，進(jìn)一步增大其質(zhì)量濃度，則抑制率明顯降低，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度增大至5 mg/mL時(shí)，出現(xiàn)了抑制率為負(fù)的情況。說明在此質(zhì)量濃度時(shí)，提取物具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，呈現(xiàn)出細(xì)胞毒性。樣品2獲得的厚樸提取物則呈現(xiàn)出相對(duì)較溫和的抗氧化作用，其細(xì)胞毒性相對(duì)較弱，除質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)抑制率降低至47.64%外，其他質(zhì)量濃度樣品的抑制率均在70%以上。 3 結(jié)論 厚樸入藥已有2 000多年的歷史，傳統(tǒng)提取工藝采用有機(jī)溶劑回流提取，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)超臨界二氧化碳萃取技術(shù)效率高于傳統(tǒng)提取[23-24]，SFE-CO2提取厚樸成分效率理應(yīng)更高，對(duì)厚樸多種提取方法比較的研究[25]結(jié)果表明采用SFE-CO2工藝提取量最高。相較于傳統(tǒng)提取工藝，SFE-CO2具有一系列優(yōu)勢(shì)，尤其是其綠色環(huán)保方面優(yōu)勢(shì)明顯�？赏ㄟ^調(diào)整提取分離的壓力和溫度獲得不同的目標(biāo)產(chǎn)物。正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果提示，對(duì)同一味中藥，提取及分離工藝變化，目標(biāo)組分不同。因此，優(yōu)化提取工藝需依據(jù)目標(biāo)組分的性質(zhì)進(jìn)行篩選，實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明。超臨界CO2萃取的工藝參數(shù)不但會(huì)影響到提取效率，還會(huì)影響提取產(chǎn)物的化學(xué)成分，這也符合超臨界CO2萃取過程中可以通過萃取及分離溫度、壓力的改變以調(diào)整其溶解能力的基本原理。同時(shí)，也提示可以根據(jù)所要提取目標(biāo)組分的性質(zhì)優(yōu)化提取及分離參數(shù)。在本研究的基礎(chǔ)上，可進(jìn)一步采用加入不同極性的溶劑作為夾帶劑可將厚樸中的組分按不同極性段進(jìn)行提取、分離，為中藥提取過程優(yōu)化提供參考，并為中藥藥效成分活性實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。亦可根據(jù)中藥藥效成分活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，針對(duì)性地設(shè)計(jì)提取及分離工藝過程，以獲得目標(biāo)明確、作用確切的中藥活性成分。 厚樸超臨界CO2提取物抗氧化活性細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，厚樸超臨界CO2提取物具有明顯的抗氧化活性，但受濃度影響也可能具有一定的抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，這也符合厚樸酚、和厚樸酚抗腫瘤的藥理作用[26]。同時(shí)對(duì)于2種不同提取工藝條件得到的提取物呈現(xiàn)不同的抑制率，可認(rèn)為隨著分離壓力及分離溫度的變化，SFE-CO2的溶解能力和黏度均會(huì)發(fā)生較大變化，因此，樣品1、2化學(xué)成分與含量差異明顯，故存在較大的活性差異。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[27]，其超臨界提取物主要為厚樸酚、和厚樸酚、magnaldehyde B、lignans、crytomeridiol，該結(jié)果亦提示在后續(xù)研究過程中可以根據(jù)活性需要針對(duì)目標(biāo)成分的性質(zhì)篩選合適的分離工藝。但其具體作用物質(zhì)、質(zhì)量濃度及機(jī)制有待于進(jìn)一步研究闡明。此外，即使是在同一工藝參數(shù)下提取獲得的提取物，分離過程的工藝參數(shù)對(duì)所獲得的成分類別影響巨大，不同分離參數(shù)下獲得的產(chǎn)物呈現(xiàn)出截然不同的藥物效應(yīng)，因此在超臨界流體提取工藝優(yōu)化過程中，應(yīng)根據(jù)目標(biāo)組分的性質(zhì)，合理設(shè)計(jì)提取、分離的工藝參數(shù)，才能真正發(fā)揮超臨界流體萃取提取分離的優(yōu)勢(shì)，為闡明中藥藥效物質(zhì)及其作用機(jī)制提供支撐。
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