999国内精品视频免费_国产真人作爱免费视頻_口口亚洲国产综合Av_99Re国产精品视频

關(guān)鍵詞: 大葉紫薇; 3 T32L1 細(xì)胞; 降血糖; 結(jié)構(gòu)

大葉紫薇( L agerst roemi a s pecious L . ) 為千屈菜科的落木喬木,主要生長于澳洲和亞洲,在我國廣東、廣西、福建等地也有種植,在菲律賓和亞洲其他國家,大葉紫薇被稱為banaba ,大葉紫薇的葉、花、果和莖傳統(tǒng)上被用來制作保健飲料,具有降血糖、抗氧化和減脂等功能[1 - 5 ] 。近年來,大葉紫薇對糖尿病的治療作用日益引起人們的重視,日本、美國、菲律賓等許多國家對其降糖和治療糖尿病的功效成分和藥理作用進(jìn)行了廣泛研究[6 - 9 ] 。明確大葉紫薇中的降血糖活性成分,對開發(fā)大葉紫薇產(chǎn)品具有重要的意義。

3 T32L1 細(xì)胞是一種成纖維細(xì)胞,在胰島素、地塞米松、32甲基212異丁基等作用下,具有轉(zhuǎn)變?yōu)橹�肪�?xì)胞的能力,近年來,被廣泛應(yīng)用于有關(guān)糖尿病的研究中[10 - 11 ] ,作者采用3 T32L1 前脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ妥鳛榻笛�糖有效成分的篩選模型,對大葉紫薇中的降血糖活性成分進(jìn)行篩選。

1 　材料與方法

1. 1 　試劑與儀器

大葉紫薇葉( L agerst roemi a s pecious L . ) , 產(chǎn)于廣西和廣東。corosolic acid :純度≥95 % ,Chro2madex 公司產(chǎn)品;硅膠G:青島海洋化工廠產(chǎn)品。正丁醇、乙酸乙酯、石油醚、冰醋酸、香草醛、高氯酸等均為分析純;葡萄糖氧化酶試劑盒、葡萄糖、L2谷氨酰胺:上海華美生物公司產(chǎn)品;胰島素、12甲基232異丁基黃嘌呤、地塞米松:美國Sigma 公司產(chǎn)品;3 T32L1 細(xì)胞,美國A TCC 提供。

CO2 培養(yǎng)箱、超凈工作臺酶標(biāo)儀、顯微鏡、旋轉(zhuǎn)真空濃縮器、冷凍干燥機(jī)、Water s600HPLC、Pyris21型差示掃描量熱儀( DSC ) 、R200D 型電子微量天平、UV —754 紫外可見分光光度計(jì)、Water s Plat2form ZMD 4000 液相色譜儀、島津IR2440 紅外光譜儀、恒溫水浴鍋、電熱烘箱、超聲發(fā)生器等。

1.2 　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 　3 T32L1 細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化　將3 T32L1 細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中,用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10 %小牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng),待細(xì)胞鋪滿瓶璧后,換用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h ,然后換以含1μg/ mL 的胰島素培養(yǎng)液再培養(yǎng)48 h ,再換用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10 %小牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng),每48 h 換培養(yǎng)液一次,待90 %以上的3 T32L1細(xì)胞呈現(xiàn)脂肪細(xì)胞表型時(shí), 再用于葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 　葡萄糖消耗能力的測定　將誘導(dǎo)分化成熟的3 T32L1 細(xì)胞換上含質(zhì)量分?jǐn)?shù)012 %BSA 的含藥培養(yǎng)液,在24 孔培養(yǎng)板中溫育48 h ,然后檢測培養(yǎng)液中的葡萄糖殘量,計(jì)算含藥培養(yǎng)的葡萄糖消耗值,同時(shí)測定空白對照組的葡萄糖消耗值,按下式計(jì)算樣品的葡萄糖消耗值能力。

式中: E 為三萜化合物對3 T32L1 細(xì)胞葡萄糖消耗提高率%; C0 為培養(yǎng)前孔中葡萄糖濃度(mmol/ L) ;C1 為加三萜化合物組培養(yǎng)后孔中葡萄糖濃度(mmol/ L) ; C2 為對照組培養(yǎng)后孔中葡萄糖濃度(mmol/ L) 。

1.2.3 　提取分離步驟　大葉紫薇葉先經(jīng)熱水和乙醇分別提取, 得熱水提取物(WE) 和乙醇提取物(AE) ,熱水提取物經(jīng)過濃縮后上HP220 大孔樹脂柱分別以水和乙醇進(jìn)行洗脫,得水提取物水洗部分(WEW) 和醇洗部分(WEA ) ; 乙醇提取物濃縮,真空干燥后后分別以石油醚、乙酸乙脂和正丁醇萃取各3 次,分別得石油醚萃取物、乙酸乙脂萃取物和正丁醇萃取萃取物,其中乙酸乙脂萃取物經(jīng)過制備薄層分離后得8 條條帶, 分別為PTLC1 、PTLC2 ⋯⋯PTLC8 ,其中PTLC6 經(jīng)過制備高效液相進(jìn)一步分離為PHPLC1 和PHPLC2 。對其中的強(qiáng)活性單體化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。

1.2.4 　制備薄層分離　將萃取物在經(jīng)活化(105 ℃,30 min) 的1 mm 厚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)015 %羧甲基纖維素鈉2硅膠G 薄板上條狀點(diǎn)樣,同時(shí)在點(diǎn)樣部分旁點(diǎn)上相同的溶液作為對照樣,在層析缸中展開,展開后取出,揮干溶劑,在對照樣的部分噴質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 %的硫酸乙醇溶液,105 ℃烘箱中10 min顯色,然后刮取于紅紫色部分相對應(yīng)的樣品部分的條帶,用甲醇為溶劑,經(jīng)200 W 超聲提取、洗脫3次,每次10 min ,洗脫液合并后真空濃縮, 加少量水凍結(jié),冷凍干燥。

1.2.5 　制備高效液相分離　采用Water s600 溶劑泵系統(tǒng), Water s600 控制單元和Water s2487 雙波長檢測器; 色譜柱:μBondparkTM C18 10 μm , 718mm ×250 mm ;流量:3 mL/ min ;檢測波長:206 nm進(jìn)樣量:100μL ;流動相:V (體積分?jǐn)?shù)60 %乙腈) ∶V (體積分?jǐn)?shù)012 %甲酸) = 60 ∶40 。

1.2.6 　高活性組分定性反應(yīng)　對高活性組分分別進(jìn)行醋酐2濃硫酸反應(yīng)(Liebermann2Burchard 反應(yīng),LB 反應(yīng)) ,五氯化銻反應(yīng)( Kahlenberg 反應(yīng)) ,三氯醋酸反應(yīng)( Rosen2Heimer 反應(yīng)) ,氯仿2濃硫酸反應(yīng)(Salkowski 反應(yīng)) 和冰醋酸2乙酰氯反應(yīng)( Tschu2gacff 反應(yīng)) 。

1.2.7 　熔點(diǎn)測定　準(zhǔn)確稱量1～2 mg 樣品平鋪于鋁制坩堝內(nèi),使之與低面緊密接觸,儀器先用銦和鋅準(zhǔn)確較正后,對樣品進(jìn)行差示掃描量熱(DSC) 測定,掃描速率4 ℃/ min ,用冰浴作為降溫介質(zhì),氮?dú)鉃榍鍜邭怏w。

1.2.8 　紅外光譜測定　采用島津IR2440 紅外光譜儀器,溴化鉀壓片,掃描波長400～4 000 cm21 。

1.2.9 　紫外光譜測定　將樣品溶于乙醇溶液中,在190 - 300 nm 的波長范圍內(nèi),每隔一定的波長測定溶液的吸光度值,繪制溶液的吸光度曲線。

1.2.10 　質(zhì)譜測定　質(zhì)譜條件:離子方式: EIS( m/ z200～1500) ; 毛細(xì)管電壓: 3188 kV ,錐孔電壓: 38V ;離子源溫度:120 ℃;脫溶劑氣溫度:250 ℃;光電倍增器電壓:650 V ;分析器真空度:216～510 mPa ;體積流量:412 L/ h 。

1.2.11 　核磁共振測定　核磁共振儀上測定氫譜(1 H2NMR) ,全去偶碳譜(13 C2NMR) ,以四甲基硅烷( TMS) 為內(nèi)標(biāo)物。

2 　結(jié)果和討論

2.1 　各組分的活性

將大葉紫薇葉的水提取物、醇提取物和醇提取物各萃取組分進(jìn)行葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表1 。

從表1 中可見,011 g/ L 、110 g/ L 和1010 g/ L的水提取物和011 g/ L 乙醇提取物P > 0105 ,與空白相比不顯著,而1010 g/ L 乙醇提取物P < 0105 ,與空白相比顯著;110 g/ L 乙醇提取物P < 01001 與空白相比非常顯著,表明促進(jìn)葡萄糖消耗能力的活性成分可能存在于乙醇提取物中。乙醇提取物的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物中,石油醚和乙酸乙酯萃取物活

性都非常顯著( P < 01001) 。采用1 mm 厚的硅膠G 薄板,對乙醇提取物的石油醚和乙酸乙酯萃取物進(jìn)行分離,發(fā)現(xiàn)石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物三萜類組分基本相同,由于石油醚萃取物呈油狀,分離困難,因此,采用乙酸乙酯萃取物進(jìn)行分離,得8 個(gè)組分PTLC12PTLC8 ,對各

組分進(jìn)行葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表2 。

從表2 可見,組分PTLC3和PTLC6 具有明顯的促進(jìn)葡萄糖消耗能力, 經(jīng)過HPLC 分析, 組分PTLC3 為單一組分, 而PTLC6 為單二個(gè)組分,PTLC6 經(jīng)過制備液相分離, 得PHPLC1 和PHPLC2 ,對這二組分進(jìn)行活性測定,結(jié)果見表3 。

　從表3 可見,組分PHPLC1 具有明顯的促進(jìn)葡萄糖消耗率的作用。

2.2 　活性組分結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 　PTLC3 和PHPLC1 的定性反應(yīng)　活性分析表明,PTLC3 和PHPLC1 具有較強(qiáng)的活性,因此,對PTLC3 和PHPLC1 進(jìn)行定性反應(yīng),結(jié)果如表4 。

　　三萜類化合物在無水情況下,與強(qiáng)酸(硫酸、磷酸、高氯酸等) 作用,會出現(xiàn)呈色反應(yīng)或呈熒光,主要是以上試劑使羥基脫水、增加雙鍵結(jié)構(gòu),再經(jīng)雙鍵移位,雙分子縮合等反應(yīng)生成共軛雙烯系統(tǒng),又在酸作用下形成陽碳離子鹽而呈色,所以產(chǎn)生一系列呈色反應(yīng)。分離的各組分各種顏色反應(yīng)均呈陽性,表明各分離組分可能含有三萜類化合物,但由于三萜類組分所發(fā)生的一些呈色反應(yīng),甾體化合物也有類似反應(yīng),所以,所分離的化合物是否為三萜化合物還需要進(jìn)一步進(jìn)行紅外、核磁等結(jié)構(gòu)分析。

2.2.2 　PTLC3 結(jié)構(gòu)分析　結(jié)構(gòu)分析結(jié)果如下:

以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的熊果酸相同[12 ] ,鑒定為熊果酸。

2.2.3 　PHPLC1 結(jié)構(gòu)分析　對斑點(diǎn)PHPLC1 進(jìn)行質(zhì)譜分析,其相對分子質(zhì)量為472 ,與文獻(xiàn)報(bào)道的corosolic acid 的相對分子質(zhì)量相同,表明其可能為corosolic acid。對其與corosolic acid 對照品進(jìn)行ESI - 和ESI + 的譜圖比較,結(jié)果見圖1 ,發(fā)現(xiàn)它們基本相同。進(jìn)一步進(jìn)行薄層對照,結(jié)果見圖2 ,兩者的Rf 相同,進(jìn)一步證明PHPLC1 化合物為corosolic acid。

3 　結(jié)　論

1) 大葉紫薇葉中三萜化合物corosolic acid 對促進(jìn)3 T32L1 細(xì)胞葡萄糖消耗影響顯著,具有降血糖的功能。

2) 首次發(fā)現(xiàn)大葉紫薇葉中存在熊果酸,與總?cè)�萜化合物都具有顯著促進(jìn)3 T32L1 細(xì)胞葡萄糖消耗的能力,也具有降血糖的功能作用。

參考文獻(xiàn):

[ 1 ] Hamamoto Syoichi ,Kogami Hideharu ,Kohata Kat suya. Glucose effect on blood glucose in rat s[J ] . Yakuri to Chiryo ,1999 ,27 (6) :1075 - 1077.

[ 2 ] Ikeda Y,Chen J2T ,Mat suda T. Effectiveness and safety of banaba tablet containing ext ract f rom banaba in patient s with mile type 2 diabetes[J ] . Japanese Pharmacology & Therapeutics ,1999 ,27 :829 - 835.

[ 3 ] Tomonori U , Iwao Ti , Masumizu M K. Antioxidative activity of water ext ract s of L agerst roemia s pecious leaves[J ] . Biosic Biotech Biochem,1997 ,61 (10) :1772 - 1774.

[ 4 ] Tomonori U , Iwao S , Takami T. Isolation of xanthine oxidase inhibitors lagerst roemia [ P ] . 日本專利:J P 2000290188 ,2002.

[ 5 ] Yoshio Ikeda , J ui2Tung Chen , Takemi Mt suda. Effectiveness and safety of banabamin tablet containing ext ract f rom ba2 naba in patient s with mild type 2 diabetes[J ] . Japan Pharmacology & Therapeutics ,1999 ,27 :829.

[ 6 ] Murakami C ,Myoga K,Kasai R , et al ,Screening of plant constituent s for effect on glucose t ransport activity in Enrlich as2 cites tumour cells[J ] . Chemical and Pharmaceutical bulletin ,1993 ,41 :2129 - 2231.

[ 7 ] Kazama Masayoshi ,Toyo Koso , Kangaku K. Influence of banaba2kuwa ext racted on plasma glucose level in rat [J ] . Food Style ,2002 ,6 (4) :98 - 102.

[ 8 ] Takeo H ,Haruko M ,Royji K, et al. Ellagitannins f rom L agerst roemia s pecious as activators of glucose t ransport in fat cells[J ] . Planta Med,2002 ,68 :173 - 175.

[ 9 ] Fan Liu , Kim J K,Li Y S ,et al ,An ext ract of L agerst roemia s pecious L . has insulin2like glucose uptake2stimulatory and adipocyte differentitation2inhibitory activities in 3T32L1 cell [J ] . Biochemical and Molecular Action of Nutrients ,2001 ,131 (9) :2242 - 2247.

[10 ] Reiko Kamei , Michinori K, Yoshinori K,et al. 2′2 benzyloxychlcone derivatives stimulate glucose uptake in 3 T32L1 adipo2 cytes[J ] . Life Sci ,2003. 73 :2091 - 2099.

[11 ] Yup Kang ,Hye Y K. Glucose uptake2stimulatory activity of amomi semen in 3T32L1 adipocytes[J ] . J of Ethnopharmacol2 ogy ,2004 ,92 :103 - 105.

[12 ] Hung Chien2Ya ,Yen Gow2Chin. Ext raction and identification of antioxidative component s of Hsiao2t sao (Mesona p rocum2 bens Hemsl) [J ] . Lebensmittel Wissenschaf t und Technologie ,2001 ,34 (5) :306 - 311.

產(chǎn)品鏈接：

 杜仲提取物   綠原酸  金銀花提取物  苦杏仁苷  枇杷葉提取物-熊果酸    大花紫薇提取物-科羅索酸

  淫羊藿苷  二氫楊梅素  獐牙菜苦苷

上禾生物  專注植提  精于高純      基于您對天然產(chǎn)物需求持續(xù)創(chuàng)新