液相色譜中的溶劑效應(yīng)---成因及影響因素 | 液相色譜中的溶劑效應(yīng)---成因及影響因素 |
| 發(fā)布時間:2021-06-03 信息來源:admin 發(fā)布人:admin 點擊次數(shù):982 |
| 在色譜理論中，樣品作為一個點被引入色譜系統(tǒng)中，不占有體積，屬于理想狀態(tài)。實際操作中，這是不可能實現(xiàn)的，通常的做法是把目標(biāo)物或含目標(biāo)物的基質(zhì)溶解在溶劑里面，然后將其注入色譜系統(tǒng)。在液相色譜法中，進樣體積處于0.1-100μl之間，絕大多數(shù)情形處于1-20μl之間(注：理想的進樣體積視色譜柱柱床截面積或柱床體積而定)，甚至小于一顆露珠。然而這個體積相對于HPLC的流動相規(guī)模卻是不容忽略的。今天，筆者以理論為指導(dǎo)以實測為依據(jù)，闡述一下樣品溶劑對液相色譜分離的影響。 1.溶劑效應(yīng)的成因 化學(xué)分析中，選擇樣品溶劑時，溶解性是首要的考慮因素，其次還應(yīng)考慮揮發(fā)性、穩(wěn)定性、毒性等因素。在液相色譜分析中，則還應(yīng)考慮樣品溶劑與分離模式的契合性。 液相色譜法中，樣品溶劑類型的選擇通常有兩種情形：其一，流動相溶解目標(biāo)物，多見于一種或極性相近的幾種目標(biāo)物測定；其二，非流動相溶解目標(biāo)物，比如天然提取物中未知物探索、極性差別較大的多種目標(biāo)物分析、某些液體物質(zhì)直接進樣(比如酒類成分分析、水中污染物分析)等。 流動相或初始比例流動相溶解樣品可以看作樣品處理的理想狀態(tài)，只要未發(fā)生體積過載（注：進樣體積超過柱體積的1%時，即存在體積過載風(fēng)險）或濃度過載，一般可以得到完美的結(jié)果。當(dāng)樣品溶劑與流動相的洗脫強度差別較大時，液相色譜的表現(xiàn)則會遭遇一些麻煩。樣品溶劑與流動相洗不一致時又存在兩種情形：其一，洗脫強度明顯強于流動相；其二，明顯弱于流動相。 簡單概括，強洗脫溶劑不均衡地參與了目標(biāo)物的洗脫，使色譜峰保留時間整體提前，而樣品在柱前的不充分?jǐn)U散導(dǎo)致了峰形扭曲。這種影響輕則導(dǎo)致峰展寬，嚴(yán)重時甚至導(dǎo)致峰裂分，給定性定量帶來災(zāi)難。 2. 溶劑效應(yīng)的影響因素 溶劑效應(yīng)若想造成巨大災(zāi)難的一個前提條件是：樣品溶劑的洗脫強度應(yīng)明顯強于流動相，否則，即使抵達柱頭時目標(biāo)物溶解在兩種溶劑中，但由于洗脫強度接近，它們在隨后的洗脫過程也不會拉開距離，也就不會裂分，甚至不會展寬。 樣品抵達柱頭的過程中，均存在樣品向周圍流動相擴散的過程，出于抑制柱外展寬的目的，分析者希望抑制這種擴散。如果目標(biāo)物溶解在流動相或與流動相強度相近的溶劑中，抑制柱外擴散能提高柱效利于分離。二者洗脫強度差別大時，如不能讓目標(biāo)物完全擴散至流動相，溶劑效應(yīng)很可能發(fā)生。 目標(biāo)物擴散的驅(qū)動力包含三部分：依靠濃度差從樣品溶劑向流動相傳質(zhì)、隨樣品溶劑向流動相擴散、層流。層流就是液體在管路中流動時，中心部分移動快、邊緣移動慢，使柱狀樣品前部突出后部凹陷的現(xiàn)象，如下 分子在液體里的移動不活躍，依靠濃度差的傳質(zhì)速度較慢，慢的甚至可以忽略不計，除非能讓樣品半天后再進入色譜柱。盡管如此，增大管路內(nèi)徑可以增大接觸面積，進而加快傳質(zhì)，而延長管路長度則能延長傳質(zhì)時間。管路的內(nèi)部是光滑而規(guī)則的圓柱形空腔，液體流動于其中通常會產(chǎn)生層流，這恰恰是目標(biāo)物擴散至流動相的主要推動力。同樣，管路內(nèi)徑越大層流越顯著。針后柱前的管路越粗越長越利于目標(biāo)物擴散至流動相。當(dāng)然即使目標(biāo)物在柱前完全擴散進入流動相，其所在的氛圍的洗脫強度也因樣品溶劑的參與而略強于流動相。 對于給定的方法和系統(tǒng)，較大的樣品體積(注：此時“樣品帶”較長)不利于目標(biāo)物完全擴散至流動相，溶劑效應(yīng)更明顯。而樣品溶劑洗脫強度越強時，色譜峰的裂分會加劇。即使因樣品體積小色譜峰沒裂分，保留時間也會前移的明顯。 2.1 進樣體積的影響 流動相溶解的樣品，進樣體積增加后，保留時間維持穩(wěn)定，半高峰寬也基本穩(wěn)定。而強洗脫溶劑溶解的樣品保留時間則隨進樣體積增大而明顯前移，直到裂分，而且峰寬也隨之增大。 對于強洗脫溶劑溶解的樣品：進樣體積較小時，擴散至流動相的目標(biāo)物占絕大多數(shù)，除了保留時間略微提前，峰形以及峰寬與流動相溶解時基本一致。體積增大到一定程度，擴散至流動相氛圍的目標(biāo)物與留在溶劑氛圍的目標(biāo)物在數(shù)量上相當(dāng)時，色譜峰分叉明顯。 當(dāng)樣品體積進一步增大，絕大多數(shù)目標(biāo)物進入色譜柱時是溶解在溶劑中的，前峰為主峰(如下圖)。此時，可能會給分析者一種錯覺:通過增大進樣體積或者通過更細(xì)的管路解決了溶劑的效應(yīng)。殊不知，色譜峰的保留時間已經(jīng)明顯提前了。任何情況下，請牢記：假如不用流動相溶解一些樣品，分析者甚至都不知道它真實的保留時間在哪里！ 2.2 柱前管路的影響 柱前管路內(nèi)徑越大、管路越長，越利于目標(biāo)物向流動相擴散，而且使用更粗的管路比更長的管路有效(注：假設(shè)死體積相同)。雖然粗的管路加劇了等度條件下的柱外展寬，對柱效有危害，然而相較于峰分叉的危害而言，前者尚能接受。 如下圖，黑色曲線使用了0.12mm. ID * 500 mm的管路（柱前），粉色曲線使用了0.25mm ID. * 500 mm的管路（柱前），樣品溶劑均為乙腈，進樣體積均為2μl。使用細(xì)內(nèi)徑管路的系統(tǒng)中峰開始分叉，而粗內(nèi)徑管路尚能維持可接受的峰形，盡管后者存在峰展寬的情況。 所以，在某些系統(tǒng)下溶劑效應(yīng)更明顯，這不是儀器不好，恰恰是這個系統(tǒng)對管路控制的太好了，才會讓溶劑效應(yīng)導(dǎo)致的峰形變形更明顯！ 2.3 其他影響因素 增大洗脫體積，比如延長柱長，或降低流動相洗脫強度增加目標(biāo)物的保留因子，可以抑制溶劑效應(yīng)。而且，色譜柱延長以后，柱前管路導(dǎo)致的柱效下降能得到彌補。這種做法相當(dāng)于不變更色譜柱規(guī)格的前提下，減小進樣體積。 2.4 特殊說明 在梯度洗脫模式下，溶劑效應(yīng)不明顯，如果真的存在，也只是影響出峰較早的色譜峰。這是因為梯度洗脫下，初始比例流動相無法洗脫目標(biāo)物，而且強洗脫溶劑也無法讓其快速移動，它們會富集在柱頭，等流動相洗脫強度提高到一定程度，化合物才會逐漸被洗脫。 對于某些保留弱的化合物，它的洗脫強度與初始比例流動相越接近，就越容易受溶劑效應(yīng)影響。因而，為了照顧出峰較早的目標(biāo)物，即使使用了梯度洗脫，也不要采用強洗脫溶劑來溶解(假如低洗脫強度溶劑能完全溶解所有目標(biāo)物)。(此處無圖，建議讀者嘗試，或者大多數(shù)讀者早就遇到過了。) 3. 溶劑效應(yīng)的危害 (1) 導(dǎo)致柱效下降，危害分離； (2) 危害峰形，危害定量，甚至危害定性；比如，在LCMS中，掃描前體離子時，遇到這種情況，甚至不知道哪個峰才是目標(biāo)物； (3) 當(dāng)標(biāo)樣和樣品的溶劑不一致時，保留時間不吻合，同樣危害定性；比如酒類成分分析，標(biāo)樣溶于純水，樣品是過濾的酒，后者的溶劑就是乙醇水，它的保留時間必定早于純水溶解的標(biāo)樣；再比如水中污染物分析，目標(biāo)物溶于有機相得到標(biāo)樣，而樣品是過濾后的天然水； (4) 強洗脫的溶劑在基質(zhì)中提取出的雜質(zhì)遇流動相會析出，堵塞針座、柱前管路或色譜柱。 4．解決辦法 如何識別溶劑效應(yīng)？ 反相色譜中，溶劑極性弱于流動相；正相色譜中，溶劑極性強于流動相。這兩種情況均有出現(xiàn)溶劑效應(yīng)的風(fēng)險。溶劑效應(yīng)中的峰裂分有兩個特點，裂分峰在正常色譜峰的前面，而且出峰越早的化合物裂分越明顯，出峰晚的化合物甚至不會受影響。色譜柱損壞(如篩板堵塞)導(dǎo)致的峰裂分，分叉峰出現(xiàn)在正常峰的右邊，而且這種影響會波及所有化合物。 下面是筆者給出的一些建議： (1) 不影響目標(biāo)物溶解性的情況下，盡量用流動相、初始比例流動相或洗脫強度盡量低的液體作為樣品溶劑； (2) 在不影響目標(biāo)物溶解的情況下，用弱洗脫強度的溶劑稀釋樣品，比如反相色譜法下，向有機溶劑中加水； (3) 為了滿足多種目標(biāo)物的提取或溶解度，必需使用強洗脫溶劑時，比如天然產(chǎn)物分析，在不影響靈敏度的情況下降低進樣體積； (4) 如果不想減少進樣體積也不想更改溶劑，可將初始流動相洗脫強度設(shè)置的較高，使初始流動相的洗脫強度與溶劑接近，然而這種方法可能會危害化合物的分離； (5) 在不影響分離的情況下，柱前改用較粗內(nèi)徑管路；(注意：假如是等度洗脫，此方法會降低柱效；假如是梯度洗脫，基本不影響柱效)。 (6) 使用進樣器預(yù)混合功能。吸樣后，針不回針座，懸�？罩�，計量泵吸-排-吸-排數(shù)次，使目標(biāo)物完全擴散至流動相。(注意：假如是等度洗脫，此方法會降低柱效；假如是梯度洗脫，基本不影響柱效)。 5. 低洗脫強度溶劑的影響 在主流文獻中，一般認(rèn)為低洗脫強度溶劑通常不影響化合物的色譜表現(xiàn)，事實也是如此。然而，在一些極端情況下，微小的影響也能被發(fā)現(xiàn)。 當(dāng)?shù)蛷姸热軇┲械哪繕?biāo)物(綠色)進入色譜柱時，此部分目標(biāo)物將基本不能向前移動，因為低強度溶劑無法洗脫它，后者被富集在柱頭(區(qū)域?qū)挾缺粔嚎s，類似梯度洗脫時的初始比例流動相)。而低強度溶劑則會持續(xù)向前移動，能追趕上最前面的那部分目標(biāo)物，在較小的時間段內(nèi)會稍稍降低最前面那部分目標(biāo)物的移動速度。前面那部分目標(biāo)物中心點與中間那部分目標(biāo)物中心點的最大時間差小于等于樣品體積/流速。 隨后，后面溶于流動相的目標(biāo)物也進入色譜柱，該部分與柱頭富集的目標(biāo)物(下圖左邊的橢圓形譜帶)一起被流動相帶著以正常速度移動，(注：該部分以較寬橢圓形顯示是為了表明這部分目標(biāo)物占大多數(shù)，并不意味它的區(qū)域?qū)挾容^寬，相反它的寬度比正常色譜峰更窄)。需要注意的是中、后部分合并的那個譜帶的保留時間要略晚于正常的保留時間，進樣體積越大，保留時間延后越明顯。 與強洗脫溶劑溶解的情形相比，低洗脫強度時，基本不會發(fā)生峰的裂分。尤其重要的是，如上圖所示，由中后兩部分組成的峰始終是主峰，并能保持較好的峰形。即使發(fā)生了前與中后部分的峰裂分，我們?nèi)阅苷业街鞣濉?br /> 以低強度溶劑不能洗脫目標(biāo)物為前提，可以大膽預(yù)測：當(dāng)進樣體積極小時，進色譜柱前，目標(biāo)物全部擴散至流動相，峰形完全正常(這與采用強洗脫溶劑時類似)。當(dāng)進樣體積極大時，進色譜柱前，擴散至流動相的目標(biāo)物占比較低，前部分目標(biāo)物占比更小，主峰明顯，前面會有較小的裂分峰。只有當(dāng)進樣體積不大不小的時候，才會出現(xiàn)明顯的裂分峰。綜合來看，低洗脫強度溶劑時對色譜峰的危害小于強洗脫溶劑。 對比了溶于流動相和純水(低強度)的caffeine，與前面分析條件相同。 由上圖可以看出，進樣體積為0.1μl、0.5μl 、1.0μl的分析中，色譜峰未發(fā)現(xiàn)裂分，但保留時間隨進樣體積增大而延后。進樣體積為1.0μl、5.0μl、10μl的分析中，色譜峰裂分出一小一大兩個峰，其中前面的小峰靠近真實保留時間(將0.1μl的進樣看作真實保留時間)，隨進樣體積增大，主峰保留時間進一步延后。這與前面關(guān)于低強度溶劑效應(yīng)的機理一致。 分析者出于提高靈敏度的目的，進樣10μl，這對于2.1mm. ID, 50 mm,的色譜柱明顯體積過載了。為了得到良好峰形，將洗脫條件改為梯度洗脫，初始流動相為純水(與樣品溶劑一致，也就是純水)。問題得到完美解決(如下圖)。 6，總結(jié) (1) 強洗脫溶劑造成的溶劑效應(yīng)主要是保留時間提前，峰裂分時，裂分峰在左。低洗脫強度溶劑造成的溶劑效應(yīng)主要是保留時間延后，但延后幅度較小，即使發(fā)生裂分，前后兩峰均能保持良好峰形。 (2) 改用流動相溶解樣品或減小進樣體積可以消除溶劑效應(yīng)；低強度溶劑稀釋樣品或梯度洗脫也是抑制溶劑效應(yīng)的好辦法；柱前改用粗內(nèi)徑管路或進樣前進行預(yù)混合可以將目標(biāo)物擴散至流動相中，能夠挽救峰形，如果是梯度洗脫，這甚至不影響柱效。但假如是等度洗脫，這會增大目標(biāo)物的柱前展寬，危害柱效，所以這兩個辦法是最后的選擇。 轉(zhuǎn)發(fā)于： 彩云 色譜與質(zhì)譜 備注：原文有很多圖片更清楚的說明了各種不同的情況和原理，進一步了解請閱讀原文，
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