制備型高效液相色譜法分離純化綠原酸 | 制備型高效液相色譜法分離純化綠原酸 |
| 發(fā)布時(shí)間:2011-01-26 信息來(lái)源:admin 發(fā)布人:admin 點(diǎn)擊次數(shù):3525 |
彭密軍1,2，周春山1，鐘世安1，劉 斌1 (1．中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙，410083； 2．吉首大學(xué)湖南省林產(chǎn)化工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南張家界，427000) 摘要：采用制備高效液相色譜技術(shù)，從杜仲葉提取物中分離純化得到高純活性成分綠原酸。對(duì)制備色譜的洗脫方式、洗脫劑組成、濃度、洗脫速度等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，提出并應(yīng)用了流動(dòng)相速度梯度洗脫方法。最佳操作條件為：采用流速梯度進(jìn)行洗脫，流速先為28 mL／min，然后為45 mL／min；流動(dòng)相為15 的有機(jī)酸B和0．1 的有機(jī)酸E(體積分?jǐn)?shù))；測(cè)定波長(zhǎng)為254 nm；進(jìn)樣體積為10 mL；進(jìn)樣量為2 500 mg。通過該工藝分離純化，制備回收率為83．3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3．1%，綠原酸的純度達(dá)98．61%，同時(shí)可得到杜仲葉黃酮、桃葉珊瑚甙等副產(chǎn)品。 關(guān)鍵詞：綠原酸；高效液相制備色譜；純化；流速梯度洗脫 杜仲(Eucommia ulmoides Oliv)是我國(guó)特有的木本植物，是一種名貴的中藥材[1] 。傳統(tǒng)上以杜仲皮入藥，但近年來(lái)的研究結(jié)果表明，杜仲葉和皮成分基本相同，特別是杜仲葉中綠原酸和黃酮的含量遠(yuǎn)高于皮中的含量[2-3]。綠原酸(chlorogenic acid，CGA)學(xué)名為3-O-咖啡�？鼘幩�(3-O-caffoylquin—ic)，具有抗菌、抗病毒、利膽、增高白血球及興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)、抗氧化、抑制高血壓等功效[4-9]。國(guó)外多以咖啡豆和金銀花為原料提取綠原酸，但金銀花的用藥部位僅限于花蕾[10]。，價(jià)格昂貴，資源有限。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，杜仲葉片中綠原酸的含量與金銀花的相當(dāng)，而且資源豐富，價(jià)格低廉[11]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)杜仲中綠原酸高純單體的分離研究基本上還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，多采用硅膠或大孔吸附樹脂反復(fù)柱層析或多級(jí)萃取，再采用重結(jié)晶法得到少量純品[12]，未見有大型的制備高純產(chǎn)品的研究報(bào)道。在此，作者采用新型制備高效液相色譜對(duì)杜仲葉中的綠原酸進(jìn)行分離純化，同時(shí)從杜仲樣品中分離純化黃酮類化合物(FL)及桃葉珊瑚甙(AU)等產(chǎn)品。 1 實(shí)驗(yàn) 1．1 儀器與試劑 1．1．1 儀 器 實(shí)驗(yàn)儀器為：HGS型制備液相色譜儀(自組)；改性C 8填料(日本Fuji生產(chǎn)，粒徑20～ 40 I|m)；HGS型紫外檢測(cè)儀；六通進(jìn)樣閥；TL一Ⅲ型流量調(diào)節(jié)儀；MN型記錄儀。Biotronik液相色譜分析儀(德國(guó)制造)；BT8200 UV 檢測(cè)器；BT8100高壓泵；Dynamic混合器；C-R6A數(shù)據(jù)處理儀(日本島津制造)；冷凍干燥機(jī)(上海制造)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生制造)；Explorer電子天平(瑞士制造)；756 MC-Vis分光光度計(jì)(上海制造)；KQ-lOOE超聲波發(fā)生器(上海制造)。 1．1．2 試 劑 實(shí)驗(yàn)試劑為：甲醇，分析純，有機(jī)酸A，B，C和D，分析純；有機(jī)酸E，分析純(試劑配制后用o．45m微孔濾膜過濾)；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)樣品(≥98．0 ，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，其結(jié)構(gòu)如圖1所示)；綠原酸粗品(由杜仲葉水提醇沉，再經(jīng)大孔吸附樹脂純化后得到)；水(為二次蒸餾水)。
1．2 色譜條件 1．2．1 制備色譜條件 ODS色譜柱(國(guó)產(chǎn)不銹鋼柱，直徑×長(zhǎng)為80 mm×500 mm，ClB粒徑為2O～40 m)；流動(dòng)相為醇水一酸(體積比為15：85：0．1)；流速梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；進(jìn)樣量為10 mL。 1．2．2 分析色譜條件 色譜條件為口引：YWG—C 8色譜柱(直徑× 長(zhǎng)為6 mm×150 mm，Cl8粒徑為5 m)；流動(dòng)相為乙腈一水一乙酸(體積比為10：88：2)；流速為1 mL／min,柱溫為25℃ ；衰減為3；紙速為3 mm／min；測(cè)定波長(zhǎng)為326 nm；進(jìn)樣體積為6 L。 1．3 綠原酸的色譜制備 稱取適量杜仲葉提取物，加入制備色譜流動(dòng)相，于超聲波中溶解15 rain，配制成 定濃度的制備樣品溶液。 制備條件如下：以15 %(體積分?jǐn)?shù))的有機(jī)酸B為流動(dòng)相，加入0．1%的有機(jī)酸E，采用先為28 mL／min，后為45 mL／min的流速梯度進(jìn)行洗脫，對(duì)CGA進(jìn)行色譜分離制備。根據(jù)紫外檢測(cè)器的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)及顯色反應(yīng)的結(jié)果[14-15]，收集各組分。在該條件下所得制備色譜圖如圖2所示�？梢�，其分離效果良好(分離度R≥1．25)。當(dāng)進(jìn)樣量為2 500 mg時(shí)，測(cè)定不同切割位置對(duì)所得組分中CGA含量的影響。在CGA峰兩側(cè)做切線，兩切線與基線相交得一區(qū)間a，在此區(qū)間(57~71 min)接取CGA組分，平行制備5次，CGA的回收率為83．8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.1%。在18～22 rain接取的為AU 組分，而在28~45min接取的為FL組分。
1．4 組分純度測(cè)定 將所收集的相應(yīng)組分置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓回收溶劑，將所得濃縮液置于真空冷凍干燥機(jī)中干燥，得到白色晶體。分別稱取5 mg產(chǎn)品，用少量分析色譜流動(dòng)相溶解，并定容到25 mL。用0．45 m 微孔濾膜過濾，按照分析色譜條件進(jìn)樣，采用外標(biāo)法測(cè)定CGA產(chǎn)品的純度 [13]，結(jié)果見表1。
由表1可見，得到的綠原酸產(chǎn)品純度很高，完全可用作生化試劑標(biāo)準(zhǔn)品，滿足新藥研發(fā)的需要。 2 結(jié)果與討論 在杜仲葉提取分離綠原酸的工藝中，主要干擾物為杜仲黃酮和桃葉珊瑚甙。由于黃酮和綠原酸都屬于多酚類物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)十分相近，采用一般經(jīng)典的溶劑萃取、柱層析均不能獲得高純度的綠原酸。在此，從以下幾個(gè)方面對(duì)制備工藝進(jìn)行研究。 2．1 流動(dòng)相組成對(duì)分離度的影響 實(shí)驗(yàn)考察了用不同低級(jí)醇作流動(dòng)相組分時(shí)對(duì)分離效果的影響。在保證CGA 與FL充分分離的條件下(R≥0．75)，考察用不同體積分?jǐn)?shù)的有機(jī)酸A，B，C和D在流速相近、添加劑量相同時(shí)對(duì)綠原酸的洗脫情況，結(jié)果如圖3所示。可見，25 的A，15 的B，1O 的C，7．5％的D的分離效果較好，其中15 的B分離效果最好。從圖3可以看出，有機(jī)酸C和D的洗脫能力較強(qiáng)，要達(dá)到較好的分離效果，其含量要低，但操作周期長(zhǎng)；若提高其在流動(dòng)相中的比例，則它們易將色素一并洗下，達(dá)不到較好的分離效果，并且這2種溶劑較難回收。在使用有機(jī)酸A作流動(dòng)相時(shí)，可以達(dá)到很好的分離效果(R≥1．5)，但運(yùn)行周期過長(zhǎng)，且有機(jī)溶劑消耗量大，不適宜用于大規(guī)模生產(chǎn)。當(dāng)使用有機(jī)酸B并加入適當(dāng)添加劑時(shí)分離效果好，且GPA與FL和AU 完全分離。故選擇B-水體系為分離制備綠原酸的流動(dòng)相，并加人適量的有機(jī)酸。 2．2 流動(dòng)相體積分?jǐn)?shù)的優(yōu)化 在制備色譜中，流動(dòng)相的體積分?jǐn)?shù)對(duì)分離效果有明顯影響。當(dāng)不加入有機(jī)酸，用不同體積分?jǐn)?shù)的有機(jī)酸B進(jìn)行等度洗脫時(shí)，發(fā)現(xiàn)低體積分?jǐn)?shù)的有機(jī)酸B對(duì)CGA 的洗脫能力不強(qiáng)，耗時(shí)太長(zhǎng)，消耗流動(dòng)相多，且分離不完全;而高體積分?jǐn)?shù)的有機(jī)酸B洗脫能力較強(qiáng)，當(dāng)流速較大時(shí)，分離效果也不佳，不能同時(shí)將CGA與AU，特別是CGA 與FL分開。經(jīng)綜合考慮，確定15%的有機(jī)酸B為流動(dòng)相(如圖4所示)。
2．3 流動(dòng)相中有機(jī)酸的作用及用量 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在制備色譜上AU 比CGA先出峰，但分離不完全，CGA 與FL的色譜峰也重疊嚴(yán)重。從分子結(jié)構(gòu)上分析，CGA分子中含有1個(gè)羧基(如圖1所示)，而AU 與黃酮?jiǎng)t無(wú)羧基。要在C，s柱上有效地分離綠原酸、黃酮與桃葉珊瑚甙，必須在調(diào)節(jié)流動(dòng)相中有機(jī)酸B的體積分?jǐn)?shù)的同時(shí)向流動(dòng)相中加入有機(jī)酸E。有機(jī)酸E的加入可抑制綠原酸的離解，延長(zhǎng)其保留時(shí)間，使得各成分徹底分離。本實(shí)驗(yàn)考察了向流動(dòng)相(15%的有機(jī)酸B)加入不同體積分?jǐn)?shù)有機(jī)酸E對(duì)分離效果的影響，結(jié)果如圖5所示。 結(jié)果表明，有機(jī)酸E的少量加入可以改善分離度和防止峰的拖尾，延長(zhǎng)CGA 的出峰時(shí)間，從而使CGA與AU，F(xiàn)L與CGA完全分離(R≥1．25)，有機(jī)酸E的較適宜體積分?jǐn)?shù)為0．10%。此外，酸性體系可以防止綠原酸在中性或堿性條件下氧化，但對(duì)保持柱的穩(wěn)定性和延長(zhǎng)柱的壽命有一定的影響。
2．4 流速及洗脫方式的確定 流速及洗脫方式對(duì)分離情況有較大的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)采用低流速時(shí)，沖出AU 和FL后還要經(jīng)很長(zhǎng)的時(shí)間才能洗脫出CGA。而采用高流速，雖然CGA可以很快洗脫出來(lái)，但CGA 與FL的分離效果不佳(R≤0．6)，影響產(chǎn)品的質(zhì)量。 為此，同時(shí)對(duì)等度洗脫、濃度線性梯度洗脫、流速梯度洗脫等方式進(jìn)行研究。鑒于本研究的原料是初步純化過的綠原酸粗品，提出了速度梯度洗脫方法，即用單一配比的流動(dòng)相，先用低流速將AU 和FL及附近的雜質(zhì)分開，待洗脫出這些化合物后，立刻將流速調(diào)高以快速洗下CGA 組分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用該方法，能使CGA與FL及AU 較好地分離(R≥1．25)。為縮短分離時(shí)間，且保持較高的分辨率，選擇先用28 mL／min，后提高至45 mL／min的流速梯度進(jìn)行洗脫。 2．5 進(jìn)樣體積對(duì)色譜分辨率的影響 進(jìn)樣量為2 500 mg時(shí)，研究了進(jìn)樣體積對(duì)色譜分辨率和綠原酸中各餾分純度的影響。結(jié)果表明：a．隨著進(jìn)樣體積增大，色譜分辨率逐漸降低，色譜峰發(fā)生擴(kuò)散；當(dāng)進(jìn)樣體積大于12 mL后，色譜分辨率急劇下降，且出現(xiàn)嚴(yán)重的不對(duì)稱峰形。b．進(jìn)樣體積越大，制備樣品中CGA純度越低。 因此，要分離制備高純度的綠原酸產(chǎn)品，進(jìn)樣體積不宜太大，選擇進(jìn)樣體積為10 mL。 2．6 進(jìn)樣量對(duì)色譜分辨率的影響 在進(jìn)樣體積相同的條件下，考察了進(jìn)樣量對(duì)色譜分辨率的影響。結(jié)果表明：隨著進(jìn)樣量的增大，色譜峰變寬，組分峰重疊加重，容量因子K 逐漸減小，分辨率降低，且進(jìn)樣量越大，制備樣品中CGA的純度越低；當(dāng)進(jìn)樣量大于2 600 mg后，出現(xiàn)峰形不對(duì)稱，峰前陡峭而峰后拖尾的現(xiàn)象，表明進(jìn)樣量已超過等溫吸附的線性范圍，選擇最佳進(jìn)樣量為2 500 mg。 2．7 討 論 綠原酸(CGA)和杜仲黃酮(FL)都是杜仲葉中含量較高的活性成分，它們結(jié)構(gòu)和性質(zhì)相近，用一般柱色譜難以分離完全。此外，杜仲葉提取物中還含有桃葉珊瑚甙(AU)。為保證得到較好的分離結(jié)果，必須對(duì)不同實(shí)驗(yàn)條件下收集的組分進(jìn)行分析檢測(cè)，并隨時(shí)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。檢測(cè)主要采用HPLC法和顯色法相結(jié)合的方法。顯色法包括黃酮一鋁鹽顯色法[1 和桃葉珊瑚甙的艾氏試劑顯色法ll51。黃酮和綠原酸都能與鋁鹽作用，前者在堿性條件下呈黃色，而后者則呈紫紅色，有明顯的顏色差異。桃葉珊瑚甙的顯色反應(yīng)具有較高的選擇性，對(duì)桃葉珊瑚甙顯藍(lán)色，而與杜仲中的其他2種主要的環(huán)烯醚萜類化合物京尼平甙酸、京尼平甙不發(fā)生顯色反應(yīng)，與CGA和FL也不發(fā)生顏色反應(yīng)。因此，在實(shí)驗(yàn)過程中，采用這2種簡(jiǎn)單易行的方法進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，效果良好。 3 結(jié)論 a．采用反相高效液相制備系統(tǒng)，以乙醇一水和少量羧酸為流動(dòng)相，制備了CGA。對(duì)分離中的主要干擾成分桃葉珊瑚甙和黃酮采用靈敏的顯色法進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，并結(jié)合高效液相色譜分析法，可得到純度為98．61 的CGA產(chǎn)品。 b．提出了速度梯度洗脫方法，分離度較高(R≥1．25)，同時(shí)節(jié)省了時(shí)間，降低了試劑的用量。 參考文獻(xiàn)： [1] Deyama T，Nishibe S，Nakazawa Y．Constituents and pharma—eological effects of Eucommia and Siberian ginseng EJ7．Actapharmacol Sin，2001，22(12)：1 057—1 070． [2] 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