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鄭成，蘭國勇

(廣州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，廣東廣州510006)

摘 要：研究了二氫楊梅素的微波輔助提取法和重結(jié)晶純化法，提取實驗中考慮了微波照射時間、加熱時間和料液比等因素對提取率的影響，確定的最佳提取工藝條件為：微波照射時間為2Orain；加熱時間為50rain；料液比為1：10，在此條件下二氫楊梅素的提取率為25．11％；純化實驗以水為結(jié)晶溶劑進(jìn)行多次重結(jié)晶，結(jié)果表明可有效的除去二氫楊梅素的雜質(zhì)，二氫楊梅素的含量由53．75％到95．75％。

關(guān)鍵詞：藤茶；二氫楊梅素；微波提取

1 藤茶及二氫楊梅素

藤茶系葡萄科蛇葡萄屬植物顯齒蛇葡萄Ampelosis grossedentate(Hanf～Mazz)W．T．Wang的嫩莖葉，味甘、淡，性涼，具有清熱解毒、祛風(fēng)濕、強(qiáng)筋骨之功效，主治皮膚癬癲、黃疸型肝炎、感冒風(fēng)熱、咽喉腫痛等。廣泛分布于我國的廣東、廣西、云南、湖南、湖jE、江西等省區(qū)，我國瑤族民間常采集其嫩莖葉，經(jīng)加工揉制、干燥，制成保健茶飲用，至今已有數(shù)百年的歷史。而二氫楊梅素(簡稱DMY)是一種多酚基雙氫黃酮醇，又稱蛇葡萄素，屬黃羥酮類化合物。二氫楊梅素大量存在于葡萄科蛇葡萄屬植物中，其中藤茶尤為特別。在部分地區(qū)的顯齒蛇葡萄植物的幼嫩莖葉中，發(fā)現(xiàn)其春夏幼嫩莖葉中二氫楊梅素的含量達(dá)到樣品干重的20％以上，最高部位—— 幼葉中的心葉可達(dá)4o％[1]。

作為一種不可多得的天然活性物質(zhì)，二氫楊梅素具有消炎、止咳、祛痰、鎮(zhèn)痛、抑菌、抗高血壓、降脂、抗腫瘤、保肝護(hù)肝等諸多生理活性，[2]此外二氫楊梅素還有很強(qiáng)的抗氧化作用和良好的抑菌、抗病毒效果，極具開發(fā)潛力。

1．1 微波輔助法提取

1．1．1 微波原理

微波提取過程的原理是極性分子或偶極性分子在微波場的作用下，產(chǎn)生每秒鐘約4．9億次的超高速轉(zhuǎn)動，極性組分產(chǎn)生偶極渦流，離子傳導(dǎo)和超高頻摩擦而在極短的時間內(nèi)生高溫，其作用一是強(qiáng)化了傳遞過程，熱量通過微波轉(zhuǎn)換得到而不存在傳遞問題，從而實現(xiàn)高強(qiáng)度的均勻加熱；二是植物內(nèi)極性分子吸收微波產(chǎn)生熱量，發(fā)生汽化或膨脹，內(nèi)滲透壓增加的破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使擴(kuò)散孔道變大，提取變的容易。

目前，微波技術(shù)在人們的生產(chǎn)生活中應(yīng)用越來越廣泛，此法在黃酮類物質(zhì)的提取上也取得了良好的效果。它在提取過程中具有反應(yīng)高效性和強(qiáng)選擇性等特點，且操作簡便，副產(chǎn)物少，產(chǎn)率高及產(chǎn)物易提純等優(yōu)點．本法多用在藥材的浸出上。

1．1．2 微波輔助法提取=氫楊梅素

目前，國內(nèi)外已經(jīng)有部分學(xué)者開展了從植物中提取二氫楊梅素的研究，主要有采用熱提取法(煎煮法、回流提取法)、浸泡提取法(滲漉法、冷浸法)及超臨界萃取法等提取方法。其中，對于熱提取法和浸泡提取法這兩類常規(guī)方法而言，常常存在著費時、費溶劑、效率低、重現(xiàn)性差、提取效率低等不足之處，而且所用溶劑通常有毒，易對環(huán)境和操作人員造成危害；而超臨界萃取雖具有節(jié)省試劑、無污染等優(yōu)點，但是回收率較差，為了獲得超臨界條件，設(shè)備的一次性投資較大，運行成本高，而且難于萃取強(qiáng)極性和大分子的物質(zhì)，故尋找一種有效的、穩(wěn)定的提取方法顯得非常必要。而微波萃取法具有設(shè)備簡單、適用范圍廣、萃取效率高、重現(xiàn)性好、節(jié)省試劑、污染小等特點，可以避免長時間的高溫引起物質(zhì)的分解，特別適合于處理熱敏性組分或從天然物質(zhì)中提取有效成分，是一種具有趣好發(fā)展前景的萃取分離方法。[3]

本實驗通過對微波輔助法大規(guī)模提取藤茶中的二氫楊梅素，為微波技術(shù)應(yīng)用到二氫楊梅素的大規(guī)模提取提供了客觀的實驗依據(jù)。

1．2 二氫楊梅素的純化

鑒于二氫楊梅素作為一種不可多得的天然活性物質(zhì)，對蛇葡萄屬植物酮提取物的分離與提純，有助于其開發(fā)成一種新型的保健品及天然食品抗氧化劑，據(jù)目前報道，二氫楊梅素的分離與純化主要有柱層析法、薄層層析法、高效液相制備色譜法等，但這些純化方法或所需設(shè)備昂貴，或操作復(fù)雜、效率較低，很難滿足大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的需求 [4]。生產(chǎn)過程中，重結(jié)晶是純化物質(zhì)常用的方法，該方法操作簡單、分離效率高，適合工業(yè)化生產(chǎn)，本實驗采用重結(jié)晶法對二氫楊梅素的分離與純化進(jìn)行探索。

2 材料與方法

2．1 主要實驗材料和儀器

藤茶葉                 購于茶葉市場

97％A1CI3．6H2O       廣州化學(xué)試劑廠

95％分析醇              廣州化學(xué)試劑廠

二氫楊梅素純品          自制

2．2 主要儀器與設(shè)備

2．3 實驗方法

2．3．1 二氫楊梅素的提取

將1000g于的藤茶葉用水充分浸泡(茶與水的比例為1：5)。在微波功率為300 W 的條件下預(yù)處理樣品(因?qū)嶒炘O(shè)備所至。需分3次預(yù)處理)。預(yù)處理后的樣品以一定的料液比用壓力鍋加熱提取。

2．3．2 二氫楊梅素的純化

將粗產(chǎn)品溶解于沸水中(粗品與水的比例為1：100，即1g粗品加入100mL沸水中；電爐加熱使其溶解，但不要超過5 min，以防二氫楊梅素在高溫下分解)。趁熱抽濾，收集濾液。讓濾液自然冷卻，收集析出物，將析出物重復(fù)上述操作。

2．3．3 二氫楊梅素的定性分析

二氫楊梅素的定性分析采用紅外光譜進(jìn)行，通過對純品的標(biāo)準(zhǔn)紅外圖譜及自制樣品的紅外圖譜進(jìn)行對照來確定。紅外光譜對化合物的鑒定和有機(jī)物的結(jié)構(gòu)分析具有鮮明的特征性，它通過吸收峰的位置、吸收峰的相對強(qiáng)度以及峰的形狀提供化合物的結(jié)構(gòu)信息，其中以吸收峰的位置最為重要。

2．3．4 二氫楊梅素的定量分析

二氫楊梅素的定量分析采用可見光吸光光度計測量：按照2．3．1 2．3．1操作后，趁熱抽取樣品液0．5 mL于5OmL的容量瓶，精密加入5％的AIC13溶液15 mL，95％乙醇定容，搖勻后，抽取5 mL，置于另一個50 mL的容量瓶中稀釋定容，搖勻后室溫放置40 min，在404 nm的波長下進(jìn)行可見吸光度的測定 5。

2．3．5 二氫楊梅素的純度測定

精密稱取二氫楊梅素樣品0．051 g，加95％乙醇溶解并定容至50 rnL，精密吸取溶液1 rnL置于50mL的容量瓶中，精確加人5％AtCI3溶液l5 mL，加95％乙醇，定容至刻度，搖勻后室溫放置40 min，于404 nm的波長下進(jìn)行可見吸光度的測定。

2．3．6 黃酮提取率及二氫楊梅素提取率的計算

供試液通過2．3．4所測出的吸光度值A(chǔ)，代人回歸方程y=6．42X-0．0156(X即為C)計算得出濃度C(mg／mL)，根據(jù)以下公式計算：

黃酮提取率％：V×50×10×C／0．5／G~loo％

V——溶劑的體積

C——濃度mg／mL

G——實驗樣品重量rng

二氮楊梅素提取率％：黃酮提取率％×0．89(0．89為二氫楊梅素在總黃酮中所占的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，是經(jīng)驗數(shù)值)

2．3．7 二氫楊梅素純度的計算

黃酮化合物純度％：50×50×C／G×100％

C——濃度mg／mL

G——實驗樣品重量mg

3．1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精密稱取二氫楊梅素對照品10．50 mg，加95％乙醇溶解并定容至10 mL．精密吸取溶液0，0．1，0．2，0．3，0．4，0．5mL分別放于10 mL容量瓶中，精確加人5％ AlCl3溶液3mL，加95％ 乙醇，定容至刻度，搖勻后室溫放置40 min，于404 tm 處側(cè)定吸收度。以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，(回歸方程A=6．42x+0．0156，r=0．9998)，制定出以下標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

3．2 提取工藝條件的確定

3．2．1 微波照射時間的影響

各取1000 g藤茶，加5000ml自來水，充分浸泡后，放入微波爐依次照射10、15、20、25、30 min，以1：8的料液比用壓力蒸汽滅菌鍋加熱50 min，趁熱抽樣按2．3．4測其吸光度值，結(jié)果如表2，并按2．3．6進(jìn)行計算得出數(shù)據(jù)，通過相關(guān)數(shù)據(jù)做出圖1。

以水為溶劑，其他條件不變的情況下，不同微波照射時間會影響到液料的溫度和有效成分的溶出，從圖3中可知，隨著連續(xù)微波輻射時間的延長黃瞳的得率將逐漸增加，而且在20 min時有一最大值。微波輻射時間延長，最直接的影響就是溶出物增加，因為隨著時間的增加，物料內(nèi)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)被影響的程度越大，因此產(chǎn)品得率提高。但由于有效成分在這一條件下，其最大溶出量有限，因此在微波輻射一段時間后黃酮的提取率變化不大，而另一方面微波時間過長，可能使藤茶葉燒焦或者燒糊，影響提取率。因此可以看出，選擇在20min即可達(dá)到較好的提取目的。

3．2．2 微波照射后加熱時間的影響

各取1000 g藤茶，加5000 mL自來水，充分浸泡后，放入微波爐依次照射20min，以1：8的料液比用壓力蒸汽滅菌鍋依次加熱30、40、45、50、55、60 min，趁熱抽樣按2+3．4測其吸光度值，結(jié)果如表3。

茶葉經(jīng)過微波處理后，細(xì)胞膜已經(jīng)破碎，部分有效成分已溶出并附在了茶葉表面，從實驗結(jié)果看，經(jīng)微波處理后，提取率隨加熱時問的延長而升高。到50 min有個最大值，原因是經(jīng)過微波處理后附著于茶葉表面部分有效成分溶到溶劑中去，同時在加熱下，充分地對茶葉進(jìn)行有效成分的提取，隨著浸提時間的延長浸提越充分，提取率也就越高，但當(dāng)加熱到一定時間時，經(jīng)過微波處理的提取率不再增加，原因一應(yīng)該是二氫楊梅素隨時間和溫度的增加，變得不穩(wěn)定，二應(yīng)該是隨溶出率提高，雜質(zhì)量增大，故檢出的提取率下降�？梢钥闯鼋�(jīng)過微波處理后，進(jìn)行加熱時間50 min下提取率最高。

3．2．3 茶與水料液比的影響

各取1000 g藤茶，加5000 mL自來水，充分浸泡后，放入微波爐依次照射20min，依次以料液比1：6，1：8，1：10(因受實驗設(shè)備限制最多可以做到1：10)用壓力蒸汽滅菌鍋加熱50 min，抽樣按2．3．4測其吸光度值，結(jié)果如表4。

可以看出，隨著溶劑用量的增加，二氫楊梅素的提取率也增加，(由于受實驗設(shè)備的限制，料液比最大只能做到1：10，根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報道，料液比應(yīng)該在1：20時比較理想。)在中藥的提取過程中，溶劑用量與物質(zhì)的溶出有一對應(yīng)的平衡關(guān)系，即有一個(飽和)溶出度的問題。溶劑用量的最低限度是保證物料剛被全部浸沒，隨著溶劑用量的增加，溶劑與物料之間的濃度差越來越大，物質(zhì)溶出也越來越容易，溶出量隨之增加。這時雖然提取物的產(chǎn)量會提高，但其中有效成分的相對含量會降低。

3．3 重結(jié)晶純化

3．3．1 重結(jié)晶純化二氫楊梅素

顯齒蛇葡萄提取物中主要成分二氫楊梅素是極性化合物，在其水提物中，不可避免地含有單寧質(zhì)蛋白質(zhì)、糖類、鹽類以及色素等雜質(zhì)，這些雜質(zhì)以結(jié)合態(tài)或游離態(tài)形式與黃酮提取物共存，因此顯齒蛇葡萄提取物總黃酮化合物含量為86％左右。二氫楊梅素在100℃左右熱水中的的溶解度約為冷水的20倍，而且采用水加熱重結(jié)晶提純法具有操作簡便、安全、廉價的特點，可認(rèn)為是首選方法[61。

3．3．2 重結(jié)晶次數(shù)與結(jié)晶物純度關(guān)系

原料中單寧質(zhì)含量高達(dá)l2％，是粗黃酮提取物產(chǎn)生苦澀味的主要物質(zhì)，經(jīng)過多次重結(jié)晶大部分的單寧質(zhì)、色素留在結(jié)晶母液中被去除。結(jié)果見圖2。

由圖2可知，以水為溶劑，經(jīng)6次重結(jié)晶，黃酮提取物中黃酮化合物的純度則由粗品中的53．75％升高至5．75％，黃酮化合物的純度隨重結(jié)晶次數(shù)的增加而呈線性增加，但4次重結(jié)晶后結(jié)晶純度升高幅度變緩。且得率隨重結(jié)晶次數(shù)的增加也見減少，黃酮化合物在水相中的結(jié)晶為針狀晶體。

3．3．3 外光譜圖

取純化后的二氫楊梅素少量加入KBr均勻混合，以壓片法測定紅外光譜，結(jié)果如圖3，二氫楊梅素的標(biāo)準(zhǔn)紅外光譜見圖4。

圖3為二氫楊梅索的紅外光譜圖，與參考文獻(xiàn)資料圖譜圖4相比較可以判斷，該紅外圖譜是二氫楊梅素的紅外圖譜，對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析結(jié)果見表5。同時對照二氫楊梅索的結(jié)構(gòu)圖，見圖5，結(jié)果顯示其具有黃酮類物質(zhì)所具備的特有基團(tuán)；酚羥基、環(huán)酮基、苯環(huán)以及環(huán)醚等基團(tuán)。

4 結(jié)論

(1)微波預(yù)處理對于黃酮類物質(zhì)的提取率有所幫助，且提取率隨微波處理時間的增加而增加，但處理時間不宜過長，一是有效成分最大溶出量有限，二是處理時間太長，可能使藤茶葉燒焦或者燒糊，而起不到提高提取率的作用。

(2)由于二氫楊梅索在冷水中的溶解度太低，宜用熱提，且提取率隨加熱時間的增長而增加，但加熱時間不宜過長，一方面二氫楊梅素隨時間和溫度的增加變得不穩(wěn)定，另一方面雜質(zhì)的

量增大，給純化增加難度。

(3)溶劑的用量與物質(zhì)的溶出有一對應(yīng)的平衡關(guān)系，合理的料液比有助于提取率的增加，但同時應(yīng)當(dāng)考慮到水資源及能源消耗的問題。

(4)以水為溶劑，采用重結(jié)晶法可有效的提高黃酮化合物的純度，經(jīng)6次重結(jié)晶，黃酮純度由粗產(chǎn)品的53．75％升高到95．75％。黃酮化合物的純度隨重結(jié)晶次數(shù)的增加成線性升高。

(5)二氫楊梅素在水中自然結(jié)晶，其形態(tài)為針狀晶體，在水相中隨時間和溫度的增加會變的不穩(wěn)定，所以應(yīng)避免過高的加熱溫度。

參考文獻(xiàn)

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