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  （袁丹胡爽 杜慧琴 畢開順 沈陽藥科大學；王瑞杰 沈陽東宇工業(yè)技術研究院）

關鍵詞：薄層色澤法；高效液相色譜法

摘要：目的建立橘紅丸中苦杏仁苷的定性、定量分析方法。方法采用薄層色譜法對橘紅丸中苦杏仁苷進行定性鑒別；并用高效波相色譜法測定苦杏仁苷的含量。結果在橘紅丸薄層色譜中，展開劑：為氯仿-甲醇-冰醋酸-水（20:10:3:1），可清晰檢出苦杏仁苷班點；HPLC測定橘紅丸中苦杏仁苷含量，苦杏仁苷線性范田1.1～18.0μg（r=0.9998），平均回收率為97.3% （RSD=2.8％），靈敏度高，結呆準確，重視性好。結論方法簡便可行，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

    橘紅丸收載于中國藥典2000年版一部中，由化橘紅、陳皮、半夏、苦杏仁和甘草等15味藥材組成；具有清肺、化痰、止咳之功效。用于治療咳嗽痰多，痰不易出，胸悶口干�，F(xiàn)代研究表明，該方中配伍藥材苦杏仁治療咳喘的有效成分為苦杏仁苷，少量口服時，該成分在苦杏仁酶及腸道菌叢中的β葡萄糖苷酶作用下產(chǎn)生微量氫氰酸，刺激呼吸中樞產(chǎn)生鎮(zhèn)咳作用，大量則會產(chǎn)生氰中毒癥狀甚至死亡。同時日本漢方制劑規(guī)格試驗項目中，苦杏仁苷為苦杏仁、桃仁配伍制劑的定量指標成分。本實驗對橘紅丸中的苦杏仁進行苦杏仁苷的TLC鑒別和HPLC含量測定，將對該制劑質(zhì)量控制及確保用藥安全有效具有科學的意義。

    1儀器和試藥

    高效液相色譜儀（LC-6A泵，SPD-6A紫外檢測器，CTO-6A柱溫箱，C-R6A數(shù)據(jù)處理機，日本島津公司）；B-5200型超聲波機（日本Yamata公司）；SHA-C型恒溫水浴振蕩器（江蘇常州國華電器有限公司）；H-26F離心機（日本Kokusan株式會社）；HSGF254薄層板（煙臺化工研究所）；有機溶媒微孔濾股，孔徑0.45μm，規(guī)格φ13mn（天美儀器有限公司）。

    苦杏仁苷對照品（純度98．5％以上，和光純藥工業(yè)株式舍社，日本）；橘紅丸A：自制模型制劑；B， C和D：三種商品制劑。所用藥材及商品制劑購自沈陽天益堂等藥店，經(jīng)本室許春最高級工程師鑒定均為正品藥材。甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

    2方法與結果

    2.1薄層色譜鑒別

    2.1.1供試溶液的制備按藥典處方量制備橘紅丸模型制劑A（6．0g/丸），稱取13．5g，加5倍量甲醇超聲提�。�42kHz）15min，離心（3500 r·min-1） 15min，取上清液濃縮至干，殘渣加水20mL溶解，以等量正丁醇萃取，取上層液10mL蒸干，殘渣以 2．5mL甲醇溶解，即為供試品溶液。

    3種市售商品制劑B，C，D分別在60℃干燥8 h。粉碎，稱取27.0g，按上法制備供試品溶液。

    按處方量制備缺苦杏仁的陰性對照品，稱取 12．5g，按上法制備陰性對照溶液。

    取苦杏仁粗粉1．0g，加甲醇10mL超聲提�。�42kHz）15min，離心（3500r·min-1）15min，取上清液即為藥材供試品溶液。

    稱取苦杏仁苷對照品3mg，加甲醇1mL溶解，制成苦杏仁苷對照品溶液。

    2．1．2薄層色譜取苦杏仁苷對照品溶液、苦杏仁藥材、模型及商品橘紅丸供試液和陰性對照液各3 μL，分別點于同一薄層板（HSGF254）上，以氯仿-甲醇-冰醋酸-水（20:10:3:1）為展開劑，上行展開8 cm，取出晾干，噴以茴香醛硫酸溶液，在105℃下烘 5min。結果顯示：苦杏仁對照藥材，橘紅丸供試品 A，B在Rf值0．51處均可檢出暗綠色苦杏仁苷斑點，而陰性對照液無此斑點（圖1）。

    2．2含量測定

    2．2．1色譜條件色譜柱：Hypersil C18柱（4．6mm ×250mm，5μm）；流動相：甲醇-乙腈-水-冰醋酸（1: 1:16:0.02）；檢測波長：210nm；流速：0.8mL· min-1；柱溫：40℃；進樣量：10μL。

    2．2．2對照品溶液的制備精密稱取經(jīng)105℃干燥2h的苦杏仁苷對照品36mg，加甲醇溶解、定容至20mL，搖勻，即得苦杏仁苷對照品溶液。

    2.2.3供試品溶液的制備橘紅丸模型制劑A及三種市售商品橘紅丸B，C，D各取5丸剪碎，分別于 60℃干燥8h，研磨混勻，精密稱取7．0g，于加蓋離心管中加甲醇10mL超聲提�。�42kHz）15min后， 40℃恒溫水浴振蕩15min，離心（3500r·min-1）15 min，上清液移至20mL量瓶中，洗滌殘渣，合并洗液，定容，微孔濾膜濾過，續(xù)濾液即為各制劑供試波。

    2.2.4陰性對照液的制備按處方量制備缺苦杏仁藥材的橘紅丸樣品，依照"2.2.3"項下制備防性對照液。

    2．2．5空白試驗精密吸取苦杏仁苷對照品溶液、供試品溶液、陰性對照液各10μL，分別注入液相色譜儀，在"2.2.1"色譜條件下測定，記錄色譜圖（圖 2）。在橘紅丸模型制劑供試液色譜圖中，與對照品色譜圖相應位置（tR=14.87min）上，確認了苦杏仁苷吸收峰，而陰性對照液色譜圖無苦杏仁苷的色譜峰，故認為無干擾。

    2．2．6線性關系考察將上述苦杏仁苷對照品溶液粘釋成不同系列濃度的對照溶液，在上述色譜條件下分別進樣測定，以進樣具（μg）為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線，回歸方程為：Y= 29043X+4103．6，r=0．9998（n=5），線性范圍： 1．10～18．4μg。

    2．2．7精密度試驗取精密稱取橘紅丸模型制劑 7．0g，按"2．2．3"項下制備供試液，按上述色譜條件連續(xù)測定4次，計算苦杏仁苷含量，所得RSD= 1．9％。

    2．2．8穩(wěn)定性試驗取"2．2．7"項下橘紅丸模型制劑供試液配制后0.5，2，4，6h時進樣，按上述色譜條件測定苦杏仁青峰面積分別為171572，168546， 165280，165451，計算RSD=1．8％，證明苦杏仁苷含量在6h內(nèi)是穩(wěn)定的。

    2．2．9回收率試驗精密稱取已知含量的橘紅丸模型制劑粉末3．5g4份，精密加入苦杏仁苷對照液適量，按"2．2．3"項下制備供試液，依法測定，計算平均回收率為97．3％， RSD=2．8％。結果見表1。

    2．2．10樣品測定取橘紅丸模型制劑及商品制劑各供試溶液10μL，采用上述HPLC測定苦杏仁苷含量。結果見表2。

    3討論

    表1回收率的測定結果n=3

    Tab Recovery results of the assay.n=3

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測定次數(shù)  樣品量   苦杏仁苷    苦杏仁苷   測定值  回收率  平均值  RSD

          /g       含量/mg     加入量/mg  /mg     /%      /%      /%

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1         3.5318   5.527       5.52       10.700  93.7

2         3.5217   5.511       5.52       10.871  97.1    97.3    2.8

3         3.4969   5.473       5.52       10.866  97.7

4         3.5071   5.489       5.52       11.036  100.5

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    表2橘紅丸中苦杏仁苷的含量測定結果n=3

    Tab Contents of amygdalin in Juhong pill.n=3

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樣品        樣品量     A        苦杏仁苷含量/mg·丸-1  RSD%

           /g                  測定量       平均值

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模型制劑A   6.9223     164795   9.59

            7.3106     169361   9.34         9.39                 1.9

            6.9419     159514   9.25

商品制劑B   7.2316     98971    5.41

            6.9087     93225    5.33         5.34                  1.2

            6.9502     92920    5.28

C           7.1044     Trace

            6.9210     Trace

            6.9986     Trace

D           6.9811     Trace

            7.1019     Trace

            7.2106     Trace

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    3．1本實驗考察了橘紅丸中苦杏仁苷在甲醇及不同比例的甲醇-水中的提取率，表明甲醇提取效率最高，故選擇甲醇作為提取溶劑。比較不同提取方法（超聲、恒溫水浴振蕩、超聲+恒溫水浴振蕩）的提取效率，選擇了超聲振蕩15min，使樣品完全分散，再恒溫水浴振蕩15min，提取效率最高，且操作簡便。

    3．2苦杏仁苷的定量方法文獻報道有薄層掃描法、氣相色譜法和高效液相色譜法等。考察了不同比例的甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水為流動相時苦杏仁苷在制劑中的分離效果。由于苦杏仁苷的龍膽雙糖部分有較多醇羥基，加入冰醋酸起離子抑制作用，最終確定以甲醇-己腈-水-冰醋酸（1： 1:16:0.02）進行分析，苦杏仁苷與相鄰峰達到基線分離，保留時間適宜。

    3.3.3種市售橘紅丸，僅有一種在線性范圍內(nèi)定量，另外2種苦杏仁苷的含量在1.0mg·丸-1以下或微量，表明目前含苦杏仁的丸劑質(zhì)量控制水平較低。

    3．4本實驗采用的薄層色譜法鑒別，操作簡便，顯色靈敏，無干擾斑點，圖譜清晰，為一較理想的復方制劑中苦杏仁苦的TLC鑒別法。