羥基喜樹堿對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞增殖抑制的最佳濃度 | 羥基喜樹堿對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞增殖抑制的最佳濃度 |
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鄧 群, 張 一, 胡國(guó)信, 袁 鏗, 袁 芳, 黃艷琴 摘要 目的: 探討羥基喜樹堿(HCPT)對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠肝星狀細(xì)胞(HSC)增殖的影響, 并觀察其對(duì)大鼠正常肝細(xì)胞的毒性作用, 確定HCPT對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞增殖抑制的最佳濃度. 方法: 大鼠肝星狀細(xì)胞株(HSC-T6)和大鼠正常肝細(xì)胞株(BRL-3A)分別在實(shí)驗(yàn)組(分別以含HCPT 濃度為0.008, 0.016, 0.031, 0.063, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 16, 32 mg/L的培養(yǎng)液作用)及對(duì)照組(單純培養(yǎng))中體外培養(yǎng)24, 48, 72 h. 應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽法(MTT法)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況, 找出對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖抑制作用最大的HCPT最佳濃度; 光鏡下觀察對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組HSC-T6細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化. 結(jié)果: 24, 48, 72 h實(shí)驗(yàn)組HSC-T6細(xì)胞的增殖率均低于對(duì)照組, 差異具有顯著性(t = 6.07-46.98, 10.98-63.97, 20.76-107.68, 均P<0.01); HCPT對(duì)HSC-T6細(xì)胞和BRL-3A細(xì)胞的增殖抑制率均隨著藥物作用濃度的升高及藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高; 當(dāng)HCPT濃度>0.5 mg/L時(shí), 對(duì)BRL-3A細(xì)胞的毒性作用顯著性增高(均P<0.05); 0.25, 0.5, 1 mg/L的HCPT作用HSC-T6細(xì)胞24 h, 光鏡下均可見(jiàn)細(xì)胞數(shù)量減少、體積縮小、核濃縮等變化, 且隨著作用濃度的增加變化更加明顯. 結(jié)論: HCPT在體外可以明顯的抑制HSC-T6細(xì)胞的增殖, 作用強(qiáng)度呈劑量-時(shí)間依賴性; 0.5 mg/L為對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖抑制作用最大的HCPT最佳濃度. 關(guān)鍵詞: 羥基喜樹堿; 肝星狀細(xì)胞; 最佳濃度 0 引言 喜樹堿(camptothecin, CPT)是從我國(guó)特有的珙桐科植物喜樹中提取的一種五環(huán)生物堿. CPT及其衍生物是目前臨床上廣泛使用的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ(TopoⅠ)抑制劑[1-3], 不僅具有抗癌作用[4-8], 而且對(duì)于許多造成相應(yīng)組織器官纖維化的細(xì)胞, 如表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等具有抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡作用[9-15]. 但目前尚未見(jiàn)CPT對(duì)肝纖維化肝星狀細(xì)胞影響的報(bào)道. 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察CPT的一種衍生物-HCPT對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠肝星狀細(xì)胞株(HSC-T6)增殖的影響, 同時(shí)對(duì)照其對(duì)大鼠正常肝細(xì)胞株(BRL-3A)的毒性作用, 找出HCPT抑制大鼠肝星狀細(xì)胞增殖的最佳濃度, 為臨床肝纖維化的防治提供新方法, 為拓寬喜樹堿的臨床應(yīng)用范圍提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù). 1 材料和方法 1.1 材料肝星狀細(xì)胞HSC-T6由上海中醫(yī)藥大學(xué)徐列明教授提供, 系SV40轉(zhuǎn)染的大鼠HSC, 具有活化HSC的表型[16]. 正常肝細(xì)胞BRL-3A購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物研究所. 羥基喜樹堿購(gòu)自深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司; 高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司; 胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司; 四甲基偶氮唑鹽(MTT)及二甲基亞砜均購(gòu)自北京Solavbia公司. 二氧化碳培養(yǎng)箱(FORMA SCIENTIFIC, USA), XSD-D2倒置顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠), 652-酶標(biāo)儀(Labststems, 芬蘭). 1.2 方法 1.2.1 羥基喜樹堿貯存液的配制: 用生理鹽水溶解羥基喜樹堿晶體并稀釋其濃度為1 g/L的貯存液, 分裝, -20℃保存, 使用時(shí)用含100 mL/L胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液稀釋至所需濃度. 1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng): 采用含有100 mL/L胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液, 在37℃, 50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng). 1.2.3 分組: 對(duì)照組為單純HSC-T6及BRL-3A細(xì)胞培養(yǎng), 實(shí)驗(yàn)組為分別以含HCPT濃度為0.008, 0.016, 0.031, 0.063, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 16, 32 mg/L的培養(yǎng)液作用的HSC-T6及BRL-3A細(xì)胞. 1.2.4 繪制HSC-T6細(xì)胞生長(zhǎng)曲線: 用含100 mL/L胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液稀釋HSC-T6細(xì)胞懸液至1×108/L, 接種細(xì)胞于24孔培養(yǎng)板中, 每孔1 mL, 放入培養(yǎng)箱中孵育, 24 h后取3孔進(jìn)行計(jì)數(shù), 在48 h和72 h重復(fù)上述操作, 72 h后換液, 每日觀察計(jì)數(shù), 連續(xù)觀察5-7 d. 以時(shí)間(d)為橫坐標(biāo), 細(xì)胞數(shù)(×108/L)為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線. 1.2.5 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)(MTT法): 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞, 調(diào)整細(xì)胞密度為5×107/L, 接種細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板中, 細(xì)胞同步化后孵育24、48、72 h, 分別加MTT, 再孵育4 h, 加入二甲基亞砜, 酶標(biāo)儀492 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度(A值), 每種濃度3個(gè)復(fù)孔, 實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次. 結(jié)果以mean±SD表示, 并計(jì)算出生長(zhǎng)抑制率. 生長(zhǎng)抑制率 = [(對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/對(duì)照組A值]×100%. 找出HCPT的最佳作用濃度. 1.2.6 形態(tài)學(xué)觀察: 將HSC-T6細(xì)胞接種至6孔板內(nèi), 待細(xì)胞貼壁后吸棄原培養(yǎng)液, 再分別加入0.25, 0.5, 1 mg/L濃度的HCPT培養(yǎng)液, 對(duì)照組加入新鮮培養(yǎng)液, 繼續(xù)培養(yǎng)24 h后, 光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài). 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 對(duì)所得數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件進(jìn)行相關(guān)分析, 計(jì)量資料數(shù)據(jù)以mean±SD表示; 多個(gè)樣本的比較采用單因素方差分析, 兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn), P<0.05為差異有顯著性. 2 結(jié)果 2.1 HSC-T6細(xì)胞生長(zhǎng)曲線在接種的第1個(gè)24 h, 細(xì)胞經(jīng)歷一個(gè)適應(yīng)期, 為生長(zhǎng)潛伏期, 24 h后細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期, 細(xì)胞數(shù)量迅速增加, 持續(xù)約5 d, 此后細(xì)胞進(jìn)入平臺(tái)期, 細(xì)胞數(shù)量開(kāi)始下降(圖1).
圖1 HSC-T6細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線. 2.2.1 HCPT對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖的影響: 各濃度的HCPT作用HSC-T6細(xì)胞, 實(shí)驗(yàn)組HSC-T6細(xì)胞的增殖率均低于對(duì)照組, 差異具有顯著性(24 h, 48 h, 72 h的t值分別為6.07-46.98 vs 10.98-63.97 vs 20.76-107.68, 均P<0.01, 表1, 圖2A). 隨著藥物濃度的升高, HCPT對(duì)HSC-T6細(xì)胞的增殖抑制率逐漸升高; 隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng), 各濃度的HCPT對(duì)HSC-T6細(xì)胞的增殖抑制率逐漸增加. 當(dāng)HCPT作用24 h及48 h時(shí), 隨著藥物濃度的增加(0.125-1 mg/L), 細(xì)胞增殖抑制率顯著性增高(F = 153.38, P<0.01 vs F = 171.37, P<0.01); 當(dāng)藥物濃度達(dá)到2-8 mg/L時(shí), 抑制率不再顯著性增加(F = 1.80, P = 0.244 vs F = 1.02, P = 0.414); 而當(dāng)藥物濃度≥16 mg/L時(shí), 與8 mg/L組比較, 抑制率又顯著增高(均P<0.05); 當(dāng)HCPT作用72 h時(shí), 僅在藥物濃度為1-2 mg/L時(shí), 出現(xiàn)抑制率不再顯著性增加的平臺(tái)期(P>0.05). HCPT分別作用HSC-T6細(xì)胞24 h, 48 h, 72 h時(shí)的IC50約為: 0.791, 0.461, 0.153 mg/L.
表1 HCPT對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞增殖的影響 (A值, mean±SD)
圖2 HCPT對(duì)兩種細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的影響. A: HSC-T6; B: BRL-3A. 2.2.2 HCPT對(duì)BRL-3A細(xì)胞的毒性作用: 各濃度的HCPT對(duì)BRL-3A細(xì)胞亦有一定的增殖抑制作用, 且隨著藥物作用濃度的升高及作用時(shí)間的延長(zhǎng), 增殖抑制率逐漸升高(圖2B). 低濃度的HCPT(濃度≤0.5 mg/L)作用時(shí)毒性作用較低(24 h, 48 h, 72 h的增殖抑制率均<30%). 當(dāng)HCPT濃度>0.5 mg/L時(shí), 對(duì)BRL-3A細(xì)胞的增殖抑制作用顯著性增高. 取與0.5 mg/L濃度組相鄰的兩個(gè)濃度組進(jìn)行觀察比較(表2), 結(jié)果顯示0.5 mg/L濃度組與1 mg/L濃度組比較差異有顯著性(P<0.05), 而與0.25 mg/L濃度組比較差異無(wú)顯著性.
表2 不同濃度的HCPT對(duì)大鼠正常肝細(xì)胞的毒性作用的比較 (A值, mean±SD) 2.2.3 HCPT的最佳作用濃度: 通過(guò)參照HCPT對(duì)BRL-3A細(xì)胞的影響, 0.5 mg/L為對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖抑制作用最大的HCPT最佳濃度(圖3).
圖3 HCPT作用24 h時(shí)兩種細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率的比較. 2.3 形態(tài)學(xué)觀察對(duì)照組HSC-T6細(xì)胞散在分布, 細(xì)胞均貼壁生長(zhǎng), 呈星形或梭形, 細(xì)胞質(zhì)均勻而透明, 胞體近中央處可見(jiàn)圓形或橢圓形的胞核(圖4A); 0.25 mg/L濃度組HSC-T6細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組有所減少, 部分細(xì)胞聚集成團(tuán), 細(xì)胞縮小、變圓(圖4B); 0.5 mg/L濃度組HSC-T6細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組明顯減少, 細(xì)胞核濃縮, 多數(shù)細(xì)胞呈卵圓形或圓形, 但仍有部分貼壁生長(zhǎng)的成纖維樣細(xì)胞, 并可見(jiàn)漂浮的細(xì)胞碎片(圖4C); 1 mg/L濃度組HSC-T6細(xì)胞數(shù)量與0.5 mg/L濃度組相似, 大部分細(xì)胞為卵圓形或圓形, 并聚集成團(tuán), 漂浮的細(xì)胞碎片進(jìn)一步增多(圖4D).
圖4 HSC-T6細(xì)胞在光鏡下的形態(tài)學(xué)觀察. A: 對(duì)照組; B: 0.25 mg/L HCPT作用24 h; C: 0.5 mg/L HCPT作用24 h; D: 1 mg/L HCPT作用24 h. 3 討論 肝纖維化是肝臟對(duì)各種原因所致肝損傷的“創(chuàng)傷愈合”反應(yīng), 也是肝硬化發(fā)生的前奏和必經(jīng)的中間環(huán)節(jié), 其主要病理改變是細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度合成和異常沉積[17-21]. HSC是肝臟中兼有肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及脂肪細(xì)胞性質(zhì)的一種間質(zhì)細(xì)胞, 是肝纖維化時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)的主要來(lái)源細(xì)胞[18-19], HSC的活化、增殖在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起核心作用[22-24]. 近年來(lái), 隨著“肝纖維化可逆轉(zhuǎn)”理論得到公認(rèn), 以HSC為靶點(diǎn)來(lái)研發(fā)抗肝纖維化藥物成為目前肝病治療領(lǐng)域的熱點(diǎn). 喜樹堿類藥物作為TopoⅠ抑制劑, 主要通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、影響細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路和細(xì)胞周期等機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤、抑制細(xì)胞增殖的作用[27-30]. HCPT是CPT的眾多衍生物中的一種, 是CPT的A環(huán)第10位上-H被-OH取代而成, 具有水溶性好, 毒副作用較小等優(yōu)點(diǎn). 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示各濃度的HCPT均可抑制HSC-T6細(xì)胞的增殖, 且作用強(qiáng)度呈劑量-時(shí)間依賴性, 與國(guó)內(nèi)劉曉明、廖立新 et al采用相同濃度的CPT、HCPT抑制人永生化表皮細(xì)胞(HaCaT)、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(ECV304)及病理性瘢痕成纖維細(xì)胞等細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似[9-11]. 值得注意的是, 單純培養(yǎng)的HSC-T6細(xì)胞生長(zhǎng)曲線中, 細(xì)胞增殖呈S形曲線, 24 h始至72 h均為其生長(zhǎng)旺盛時(shí)期, 直至細(xì)胞生長(zhǎng)至第6-7天時(shí)才出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)量下降, 表明細(xì)胞逐漸進(jìn)入平臺(tái)期至衰亡期, 推測(cè)其原因可能是由于培養(yǎng)板提供的細(xì)胞生長(zhǎng)空間有限, 細(xì)胞不能在培養(yǎng)孔內(nèi)無(wú)限增殖, 導(dǎo)致細(xì)胞增殖受到抑制所致. 而在HCPT分別作用24 h, 48 h, 72 h時(shí), 均出現(xiàn)一段抑制率無(wú)顯著性增加的平臺(tái)期, 可能由于藥物對(duì)HSC-T6細(xì)胞的增殖抑制作用與HSC-T6自身的生長(zhǎng)增殖達(dá)到一個(gè)平衡, 使平臺(tái)期提前出現(xiàn)所致. 當(dāng)HCPT濃度超過(guò)一定范圍(≥16 mg/L)時(shí), 對(duì)HSC-T6細(xì)胞的抑制作用顯著性增加, 主要為非特異性細(xì)胞毒性作用. HCPT作為臨床上廣泛使用的抗腫瘤藥物, 在抑制腫瘤細(xì)胞及成纖維細(xì)胞增殖的同時(shí), 也可能對(duì)正常組織器官尤其是對(duì)肝臟產(chǎn)生一定的毒性作用. 因此, 用HCPT干預(yù)HSC-T6細(xì)胞的同時(shí), 也必須考慮到其可能存在的肝細(xì)胞毒性, 但縱觀國(guó)內(nèi)外有關(guān)中草藥治療肝纖維化、作用于肝星狀細(xì)胞的文獻(xiàn), 尚未檢索到通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)直接比較相同條件下藥物對(duì)兩種細(xì)胞(肝星狀細(xì)胞和正常肝細(xì)胞)的毒性作用, 從而確定藥物最佳濃度(對(duì)肝星狀細(xì)胞增殖抑制作用最大, 同時(shí)對(duì)正常肝細(xì)胞毒性作用最小的濃度)的報(bào)道. 本實(shí)驗(yàn)選取相同條件下HCPT對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠正常肝細(xì)胞株BRL-3A細(xì)胞的毒性作用作為參照, 結(jié)果顯示, 當(dāng)HCPT作用24 h, 濃度為0.5 mg/L時(shí), 對(duì)HSC-T6細(xì)胞的增殖抑制率約為50%, 而對(duì)BRL-3A細(xì)胞的增殖抑制率<15%; 當(dāng)HCPT濃度>0.5 mg/L時(shí), BRL-3A細(xì)胞的抑制率曲線陡峭上升, 提示抑制率顯著性升高, 而HSC-T6細(xì)胞的抑制率曲線較平緩, 提示增殖抑制率無(wú)顯著性升高. 綜合HCPT對(duì)兩種細(xì)胞的作用, 確定0.5 mg/L為對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖抑制作用最大的HCPT最佳濃度. 同時(shí), 通過(guò)光鏡下觀察HSC-T6細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化, 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)量明顯減少, 細(xì)胞體積縮小、核濃縮等變化, 且隨著作用濃度的增加, 上述改變愈加顯著. 因此我們推測(cè)HCPT抑制HSC-T6細(xì)胞增殖的同時(shí), 可能誘導(dǎo)了其凋亡, 但需要進(jìn)一步的研究. 總之, 本實(shí)驗(yàn)確定HCPT對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖抑制的最佳濃度, 為下一步研究HCPT對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞生物學(xué)特性的調(diào)控奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).
背景資料 肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展至肝硬化的必經(jīng)階段, 但目前仍缺乏有效的治療手段. 積極研究開(kāi)發(fā)新的抗肝纖維化藥物, 以阻斷和逆轉(zhuǎn)肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展, 對(duì)慢性肝病的治療具有十分重要的意義. 喜樹堿是從我國(guó)特有的珙桐科植物喜樹中提取的一種五環(huán)生物堿, 喜樹堿類藥物對(duì)于許多造成組織器官纖維化的細(xì)胞, 如表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞等均具有抑制其增殖、誘導(dǎo)凋亡作用, 但目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)喜樹堿對(duì)肝纖維化肝星狀細(xì)胞作用的文獻(xiàn)報(bào)道. 同行評(píng)議者 于聰慧, 教授, 中國(guó)人民解放軍北京軍區(qū)總醫(yī)院肝膽外科 研發(fā)前沿 肝星狀細(xì)胞的活化、增殖在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起核心作用, 以肝星狀細(xì)胞為靶點(diǎn)來(lái)研發(fā)抗肝纖維化藥物成為目前肝病治療領(lǐng)域的熱點(diǎn). 中醫(yī)中藥是我國(guó)原創(chuàng)的優(yōu)勢(shì)學(xué)科, 應(yīng)用中醫(yī)藥進(jìn)行抗肝纖維化的研究具有很大的發(fā)展前景和優(yōu)勢(shì). 相關(guān)報(bào)道 林熙然 et al先后用喜樹堿作用于人類角朊細(xì)胞、人永生化表皮細(xì)胞, 結(jié)果顯示一定濃度的喜樹堿能抑制上述細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)分化及凋亡. 畢燕龍 et al在研究喜樹堿對(duì)兔結(jié)膜成纖維細(xì)胞(FB)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn), 無(wú)論是體內(nèi)還是體外實(shí)驗(yàn), 喜樹堿均具有抑制FB增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用. 創(chuàng)新盤點(diǎn) 本文在國(guó)內(nèi)外首次觀察了羥基喜樹堿對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠肝星狀細(xì)胞和大鼠正常肝細(xì)胞的抑制作用及毒性反應(yīng), 探討了羥基喜樹堿對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞增殖抑制的最佳濃度. 應(yīng)用要點(diǎn) 羥基喜樹堿在體外可以明顯的抑制大鼠肝星狀細(xì)胞的增殖, 0.5mg/L為羥基喜樹堿對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞增殖抑制的最佳濃度, 為下一步研究羥基喜樹堿對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞生物學(xué)特性的調(diào)控奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ). 同行評(píng)價(jià) 本研究通過(guò)羥基喜樹堿對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠肝星狀細(xì)胞增殖的影響找出HCPT抑制大鼠肝星狀細(xì)胞增殖的最佳濃度和毒性作用, 為喜樹堿的臨床應(yīng)用范圍提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù). 4 參考文獻(xiàn) 1 Hsiang YH, Hertzberg R, Hecht S, Liu LF. 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