HPLC法測定陜西女貞子中齊墩果酸與熊果酸的含量 | HPLC法測定陜西女貞子中齊墩果酸與熊果酸的含量 |
| 發(fā)布時間:2011-04-13 信息來源:admin 發(fā)布人:admin 點擊次數(shù):2877 |
戚志華,王四旺 中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系藥物研究所,陜西 西安 710032 【摘要】 目的測定陜西境內(nèi)不同產(chǎn)地、不同生長期女貞子中齊墩果酸與熊果酸的含量。方法 采收陜西境內(nèi)關(guān)中3市(渭南、西安、寶雞)與陜南2市(安康、漢中)10月產(chǎn)女貞子；并采收西安8、9、10、11和12月產(chǎn)女貞子,去雜質(zhì)陰干,室溫密閉貯藏。采用HPLC法,Lichrospher C18(4.6 mm×250 mm,5 μm) 色譜柱,Waters600高效液相色譜儀,流動相為乙腈-甲醇-水-磷酸-三乙胺(50∶30∶20∶0.02∶0.04),流速1 mL/min。建立標準工作曲線,檢測各地、各時間點樣品中齊墩果酸和熊果酸含量。結(jié)果 安康產(chǎn)女貞子中齊墩果酸與熊果酸含量均達到同期最高。不同生長期女貞子在10月份出現(xiàn)齊墩果酸含量最高值；而熊果酸在幼果中(8月)含量最高并隨生長期延長逐漸下降。到12月時二者含量均降至最低。結(jié)論 女貞子在不同產(chǎn)地、不同生長期齊墩果酸和熊果酸的含量是不同的,故在實際應(yīng)用時應(yīng)根據(jù)不同需要適時采收。 【關(guān)鍵詞】 女貞子；陜西；齊墩果酸；熊果酸；高效液相色譜法 女貞子是木犀科植物女貞(Ligustrum lucidum Ait.)的果實,在我國藥材資源豐富,具有滋補肝腎、明目烏發(fā)之功效[1]。女貞子中含有齊墩果酸、熊果酸、甘露醇、多糖及微量元素等多種成分,已見的報道中齊墩果酸與熊果酸是其發(fā)揮藥理作用的主要有效成分。這兩種成分的含量與女貞子的生長空間、時間的變化密切相關(guān)。本實驗測定陜西境內(nèi)不同地點、不同生長期女貞子中齊墩果酸和熊果酸的含量,對于指導(dǎo)該藥的采收時間及合理應(yīng)用具有實際意義。 1 臨床資料 Waters600高效液相色譜,2996二極管陣列檢測器,7725i手動定量進樣閥,Empower軟件。Agilent微量進樣器。R200D電子分析天平(德國Sartorius公司)。250LH超聲波清洗器(上�？茖�(dǎo)超聲儀器有限公司)。 流動相所用甲醇、乙腈均為色譜純(美國Fisher公司),超純水(美國Millipore純水系統(tǒng))；磷酸、三乙胺(AR,西安化學(xué)試劑廠)。齊墩果酸對照品(中國藥品生物制品檢驗所,批號110709-200304)；熊果酸對照品(中國藥品生物制品檢驗所,批號110742-200415)。女貞子藥材采自陜西境內(nèi)不同產(chǎn)地,經(jīng)陜西省藥品檢驗所鑒定該藥材系木犀科植物女貞(Ligustrum lucidum Ait.)的果實。 2 方法與結(jié)果 2.1 色譜條件 色譜柱Lichrospher C18(4.6 mm×250 mm,5 μm,江蘇漢邦公司)；流動相：乙腈-甲醇-水-磷酸-三乙胺(50∶30∶20∶0.02∶0.04)；流速：1 mL/min；檢測波長：205 nm；柱溫：室溫；進樣量：20 μL。 2.2 對照品溶液的制備 精密稱取齊墩果酸與熊果酸對照品12.68、5.12 mg,分別置25 mL容量瓶中,加甲醇制成每1 mL分別含0.507 2 mg齊墩果酸與0.204 8 mg熊果酸的混合溶液,搖勻,即得對照品貯備液,備用。 2.3 供試品溶液的制備 精密稱取過65目篩的女貞子干燥粉末0.2 g,加甲醇50 mL,稱重,超聲處理30 min,取出,放冷,再稱定重量,用甲醇補足減失的重量,搖勻,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾,即得供試品溶液。 2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取2.2項下對照品貯備液1、2、3、4、5 mL,分別置于10 mL容量瓶中,甲醇定容,搖勻,得5個不同濃度的混合對照品溶液。分別精密吸取20 μL,按上述色譜條件進樣分析。以濃度X(μg/mL)為橫坐標、峰面積Y為縱坐標繪制標準曲線并計算回歸方程�；貧w方程為：齊墩果酸Y=12 373.29X+108 249.93, r=0.999 6；熊果酸Y=12 098.02X+85 955.73,r=0.999 8。結(jié)果表明：齊墩果酸在50.72～253.6 μg、熊果酸在20.48～102.4 μg呈良好的線性關(guān)系。 2.5 精密度試驗 精密吸取同一混合對照品溶液20 μL,按上述色譜條件,重復(fù)進樣5次,測得齊墩果酸、熊果酸峰面積的RSD分別為1.3%、2.2%。 2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品,按供試品溶液的制備方法操作,分別于0、1、2、4、8 h精密吸取20 μL進樣,測得齊墩果酸、熊果酸峰面積的RSD分別為1.7%、2.3%。結(jié)果表明,供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。 2.7 重復(fù)性試驗 精密稱取同一樣品10月樣(№3)5份,按供試品溶液制備方法分別制備5份供試品溶液,測得齊墩果酸、熊果酸含量的RSD分別為0.64%、2.9%。 2.8 加樣回收率試驗 取已知含量的供試品5份,分別精密加入一定量齊墩果酸與熊果酸對照品,照供試品溶液的制備方法進行處理,按上述測定方法進行測定,計算回收率。結(jié)果見表1。表1 加樣回收率試驗結(jié)果(略) 2.9 樣品含量測定 取不同產(chǎn)地、不同生長期的女貞子樣品0.2 g,按2.3項下方法制成供試品溶液,在上述色譜條件下,每個樣品重復(fù)測定5次,測量峰面積并用外標法計算樣品中齊墩果酸與熊果酸的含量。對照品和樣品的高效液相色譜圖見圖1,樣品含量測定結(jié)果見表2、表3。表2 陜西境內(nèi)不同產(chǎn)地女貞子中齊墩果酸和熊果酸的含量（略）表3 西安產(chǎn)不同生長期女貞子中齊墩果酸和熊果酸的含量（略） 3 討論 3.1 空間環(huán)境對植物的影響(不同產(chǎn)地) 由表2可見,陜西地區(qū)在同一時期安康產(chǎn)女貞子中的齊墩果酸和熊果酸的含量最高,這與當?shù)氐臍夂颦h(huán)境(氣溫、日照、土壤)等因素有關(guān)。女貞子屬常綠植物,適宜生長在溫暖潮濕的環(huán)境,陜北最冷月1月平均氣溫為-10～-4 ℃,故女貞子不適宜在陜北生長。本次研究未涉及陜北地區(qū)。 3.2 時間變化對植物的影響(不同生長期) 通常認為女貞子在12月冬至前后果實紫黑色且飽滿即為成熟,并大多在此時采收。由表3可見,不同生長期女貞子在10月份出現(xiàn)齊墩果酸含量最高值；而熊果酸在幼果中(8月)含量最高并隨生長期延長逐漸下降。到12月時二者含量均降至最低。故中藥材的采收應(yīng)考慮其有效成分含量的動態(tài)變化,再結(jié)合其產(chǎn)率,以保證藥物能發(fā)揮最大的療效和節(jié)約資源。 3.3 流動相的選擇 齊墩果酸和熊果酸為五環(huán)三萜類同分異構(gòu)體,在中性流動相中三萜酸可解離,很難分離。參考文獻[2-3]實驗中曾采用的甲醇-水(90∶10)、乙腈-水(80∶20)、乙腈-水-磷酸(75∶25∶0.02)、甲醇-0.5%醋酸銨溶液(90∶10)、乙腈-0.5%冰醋酸(75∶25)、乙腈-甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(50∶30∶20∶0.02∶0.04)等多種流動相,分離效果均不理想。其中選擇冰醋酸峰形較平,故選用磷酸。通過加入適量磷酸和三乙胺調(diào)節(jié)流動相pH值,可抑制齊墩果酸和熊果酸的解離,改善色譜峰的峰形,且pH值對齊墩果酸和熊果酸的分離有較大影響。經(jīng)過反復(fù)實驗,最終選擇乙腈-甲醇-水-磷酸-三乙胺(50∶30∶20∶0.02∶0.04)作為流動相,在此條件下,所得圖譜基線平穩(wěn),齊墩果酸和熊果酸達到了較好的分離。 【參考文獻】 [1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社, 2005.31. [2] 石心紅,郭江寧,翟靜華.HPLC法測定女貞子中齊墩果酸、熊果酸的含量[J].海峽藥學(xué),2005,17(4)：41. [3] 李 濤,郝武常,徐長根,等.HPLC-ELSD法測定不同產(chǎn)地女貞子中齊墩果酸與熊果酸的含量[J].中藥材,2005,28(5)：391. 杜仲提取物 綠原酸 金銀花提取物 苦杏仁苷 枇杷葉提取物-熊果酸 大花紫薇提取物-科羅索酸 上禾生物 專注植提 精于高純 基于您對天然產(chǎn)物需求持續(xù)創(chuàng)新 |
