杜仲愈傷組織與懸浮細胞中黃酮和綠原酸積累研究 | 杜仲愈傷組織與懸浮細胞中黃酮和綠原酸積累研究 |
| 發(fā)布時間:2011-04-18 信息來源:admin 發(fā)布人:admin 點擊次數(shù):2648 |
張志斌１，顏日明１，邱曉芳１，曾慶桂１，游海１，朱篤１，２ （１江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院江西省亞熱帶植物資源保護與利用重點實驗室，江西南昌３３００２２； ２江西省天然藥物活性成分研究重點實驗室，江西宜昌３３６０００） 摘要 比較杜仲愈傷組織和懸浮細胞生長及其次生代謝產(chǎn)物黃酮和綠原酸的積累。將杜仲無菌苗真葉誘導(dǎo)的愈傷組織進行懸浮培養(yǎng)，研究了懸浮培養(yǎng)物生長的動態(tài)和總黃酮類及綠原酸產(chǎn)量積累的動態(tài)。杜仲愈傷組織中黃酮和綠原酸最高分別達到１３.４６，１.７１２ｍｇ·ｇ－１，而懸浮細胞中黃酮和綠原酸最高分別達到１６.６３，３.９３ｍｇ·ｇ－１。與愈傷組織相比，懸浮細胞具有生長周期短、速率快、黃酮和綠原酸積累量高的優(yōu)勢。 關(guān)鍵詞 杜仲；愈傷組織；懸浮細胞；黃酮；綠原酸 杜仲ＥｕｃｏｍｍｉａｕｌｍｏｉｄｅｓＯｌｉｖ．為杜仲科杜仲屬植物，目前從其皮和葉中分離并鑒定的活性藥用成分包括綠原酸、黃酮類、桃葉珊瑚苷等３０余種。其中綠原酸具有降壓、抗菌、抗病毒等作用，而黃酮類化合物具有預(yù)防骨質(zhì)疏松，降血脂血糖等藥用功 效［１］。 近幾年來，通過剝皮、采葉來提取藥用成分是目前生產(chǎn)杜仲產(chǎn)品的主要手段。由于剝皮和采摘葉片對杜仲的生長具有很大影響，加之自然環(huán)境的破壞，使杜仲野生植物資源日趨貧乏。因此，為了更有效的保護杜仲種質(zhì)資源，研究利用細胞培養(yǎng)方法進行杜仲次生代謝產(chǎn)物的工業(yè)化生產(chǎn)勢在必行。迄今，杜仲組織快繁以及培養(yǎng)條件對其次生代謝產(chǎn)物合成影響的研究在國內(nèi)外已有較多的文獻報道［２６］。但有關(guān)杜仲懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的研究不多，如ＷａｎｇＪＬ等［７］進行杜仲懸浮培養(yǎng)產(chǎn)綠原酸的研究，但培養(yǎng)懸浮細胞最終質(zhì)量濃度僅達１ｇ·Ｌ－１。王亞琴等［８］不同理化因子對懸浮細胞生長及桃葉珊瑚苷的產(chǎn)生進行了研究。本實驗研究了愈傷組織和懸浮細胞在培養(yǎng)過程中生長和次生代謝產(chǎn)物積累特征，比較了愈傷組織和懸浮細胞中綠原酸和黃酮的積累規(guī)律，以期為大規(guī)模細胞培養(yǎng)生產(chǎn)杜仲次生代謝產(chǎn)物提供理論和方法依據(jù)。 １ 材料與方法 １．１ 杜仲種子 杜仲種子２００６年１１月采于廬山，由南昌大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院黃兆祥教授鑒定。 １．２ 愈傷組織的誘導(dǎo)［９］ 杜仲愈傷組織系由杜仲種子萌發(fā)的無菌苗真葉誘導(dǎo)，誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為１０ｍｇ·Ｌ－１２，４Ｄ＋１０ｍｇ·Ｌ－１ＮＡＡ＋１０ｍｇ·Ｌ－１６ＢＡ＋０７％瓊脂的ＭＳ培養(yǎng)基。誘導(dǎo)的愈傷組織接種于Ｂ５＋０５ｍｇ·Ｌ－１ＮＡＡ＋１０ｍｇ·Ｌ－１６ＢＡ＋３％蔗糖＋０７％瓊脂的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)。愈傷組織８～１０ｄ繼代１次，經(jīng)過４～５代的馴化培養(yǎng)得到無性細胞系。 １．３ 細胞懸浮培養(yǎng)體系的建立 將生長旺盛、結(jié)構(gòu)疏松、易于分散的愈傷組織轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基（Ｂ５＋０５ｍｇ·Ｌ－１ＮＡＡ＋０６ｍｇ·Ｌ－１６ＢＡ＋３％蔗糖）中，置于搖床中進行懸浮培養(yǎng)。培養(yǎng)１周后，培養(yǎng)液中即有懸浮單細胞或小細胞團出現(xiàn)。繼代培養(yǎng)時，加入等量的新鮮培養(yǎng)液，搖勻，稍靜置，待大細胞團沉降后分瓶，不需過濾，即可得到不含大細胞團塊的培養(yǎng)物。這樣通過３～４次繼代培養(yǎng)，即可得到只含單細胞或小細胞團的培養(yǎng)物。 １．４ 細胞生長的測定 愈傷組織：每隔２ｄ隨機抽�。称坑鷤M織培養(yǎng)物測其質(zhì)量。從培養(yǎng)容器中取出培養(yǎng)所得愈傷組織，用濾紙吸凈其表面水分，稱其鮮重，真空冷凍干燥至恒重，稱組織干重。實驗重復(fù)３次，結(jié)果取其平均值。 懸浮細胞：每隔２ｄ隨機抽�。称繎腋∨囵B(yǎng)物測其質(zhì)量。懸浮培養(yǎng)細胞經(jīng)尼龍網(wǎng)過濾，蒸餾水洗滌３次，稱重即得其鮮重，真空冷凍干燥至恒重，稱重即為細胞干重。實驗重復(fù)３次，結(jié)果取其平均值。 １．５ 黃酮、綠原酸的提取與測定 １．５．１ 提取方法 將干燥至恒重的愈傷組織和懸浮細胞分別準確稱�。�.２ｇ，用１０ｍＬ８０％甲醇９０℃恒溫水浴熱提５ｈ［１０］，所得提取液為供測液備用。 １．５．２ 黃酮的測定方法 將上述提取液用濾紙初過濾，吸取濾液０.５ｍＬ，加２ｍＬ甲醇，０２５ｍＬ５％ＮａＮＯ２，搖勻，放置６ ｍｉｎ，再加０.２５ ｍＬ １０％Ａｌ（ＮＯ３）３搖勻放置６ｍｉｎ后，加２ｍＬ４％ ＮａＯＨ搖勻，放置１５ｍｉｎ后在５１０ｎｍ波長下測定其吸光度［１１］�；貧w方程為Ｙ＝０.８３４４３Ｘ，Ｒ２ ＝０.９９９２（Ｙ為質(zhì)量濃度ｇ·Ｌ－１，Ｘ為吸光度）。 １．５．３ 綠原酸的測定方法［１２］ 將提取物用０.４５μｍ微孔濾膜再次過濾，以２０μＬ的進樣量進樣檢測。儀器Ａｇｉｌｅｎｔ１１００高效液相色譜儀；色譜柱ＨｙｐｅｒｓｉｌＣ１８ＯＤＳ（４６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）；流動相乙腈水磷酸（１２∶８７.９∶０.１）；流速１ｍＬ·ｍｉｎ－１；檢測器ＵＶ３２７ｎｍ�；貧w方程為Ｙ＝０.０１４２６Ｘ，Ｒ２ ＝０９９９１（Ｙ為質(zhì)量濃度ｍｇ·Ｌ－１，Ｘ為峰面積）。 ２ 結(jié)果與分析 ２．１ 杜仲愈傷組織的生長和次生代謝產(chǎn)物的積累將繼代４代以上生長旺盛、質(zhì)地疏松的愈傷組織接種到固體培養(yǎng)基上。每隔２ｄ測定培養(yǎng)愈傷組織的干重、黃酮及綠原酸的含量（圖１）。
圖１ 杜仲愈傷組織生長及其次生代謝產(chǎn)物積累 杜仲愈傷組織生長大致呈“Ｓ”型曲線，０～４ｄ為其延遲期，是細胞生長的適應(yīng)期，細胞的生物量增長緩慢。第４天以后，逐漸進入對數(shù)生長期，對數(shù)生長期持續(xù)在４～１６ｄ，此期間細胞處于旺盛的分裂狀態(tài)，是生物量積累的主要階段。到第１６天時細胞干重達到０.２４３６ｇ／瓶，黃酮從３.５７ｍｇ·ｇ－１增加到１３.４６ｍｇ·ｇ－１，增加３.７８倍，而綠原酸從０.４３６ｍｇ·ｇ－１增加１７１２ｍｇ·ｇ－１，增加了將近４倍。培養(yǎng)的第１６～２０天細胞進入減速生長期，隨著培養(yǎng)時間的延長愈傷組織干重增加緩慢，黃酮和綠原酸含量呈逐漸降低趨勢。在培養(yǎng)的１８ｄ生物量干重達到最大為２.４９２ｍｇ· ｇ－１，而黃酮和綠原酸分別為１０.８３，１.６０４ｍｇ·ｇ－１。李琰［４］和唐建軍［５］等在研 究不同理化因子對杜仲愈傷組織中次生代謝產(chǎn)物積累的影響時，也發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的后期次生代謝產(chǎn)物的含量呈下降趨勢。 ２．２ 杜仲懸浮細胞的生長和次生代謝產(chǎn)物的積累取經(jīng)過３次繼代獲得的形態(tài)均勻，生長旺盛的杜仲細胞作為種子細胞系接入到懸浮培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，每２ｄ隨機抽取３瓶培養(yǎng)物，測定細胞干重及黃酮、綠原酸的產(chǎn)量（圖２）。
圖２ 杜仲懸浮培養(yǎng)細胞生長及其次生代謝產(chǎn)物積累 懸浮培養(yǎng)生長曲線和愈傷組織生長曲線類似，細胞生長曲線基本為“Ｓ”型，但其滯后期非常短，僅有２ｄ，很快進入了對數(shù)生長期。在４～８ｄ時細胞增殖最快，而此時細胞增長速度也最快，達到０.６ｇ·Ｌ－１·ｄ－１。到第８天以后，細胞生長速率迅速下降，同時細胞進入生長平穩(wěn)期，生物量不再增加。在培養(yǎng)前期，黃酮和綠原酸的積累隨著細胞生物量的增長而逐漸增加，但２種代謝物的積累狀況各不相同，綠原酸產(chǎn)量于培養(yǎng)第１０天達到最高值２６.５７ｍｇ·Ｌ－１，隨后隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸減少；而黃酮的積累隨著細胞生長而增加，當細胞生長進入停滯期時黃酮的產(chǎn)量仍在增加，呈現(xiàn)典型的部分生長耦聯(lián)型產(chǎn)物合成特征，這和新疆雪蓮細胞懸浮系中黃酮的積累特點相似［１３１４］。 ２．３ 杜仲愈傷組織和懸浮細胞的生長和次生代謝產(chǎn)物積累的比較杜仲愈傷組織和懸浮細胞的生長曲線相似，但愈傷組織的生長周期更長，生物量增殖速度更小。與愈傷組織的生長過程相比，懸浮細胞培養(yǎng)具有生長快、周期短、產(chǎn)率高的明顯優(yōu)勢。同時作者比較了杜仲愈傷組織和懸浮細胞中黃酮和綠原酸的過程積累量。在相同的培養(yǎng)時間下，懸浮細胞黃酮和綠原酸的含量都要比愈傷組織高（圖３，４）。懸浮細胞在生長周期內(nèi)黃酮和綠原酸積累的最高質(zhì)量分數(shù)分別為１６.６３，３.９３ｍｇ·ｇ－１，而愈傷組織最高分別達到１３.４６，１.７１２ｍｇ·ｇ－１。由此可以看出，和愈傷組織培養(yǎng)相比，懸浮細胞培養(yǎng)對于次生代謝產(chǎn)物的積累具有明顯的優(yōu)勢。因此，在野生資源面臨枯竭，人工種植無法滿足市場對杜仲藥源的需求情況下，工業(yè)上利用杜仲懸浮細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物就更具有實際意義。
圖３ 杜仲愈傷組織和懸浮細胞中黃酮含量的比較
圖４ 杜仲愈傷組織和懸浮細胞中綠原酸含量的比較 ３ 討論 由于細胞與培養(yǎng)環(huán)境的相互作用，植物細胞固有的代謝途徑和代謝產(chǎn)物與細胞生長的關(guān)系就變得更為復(fù)雜。一般認為懸浮細胞次生代謝產(chǎn)物的含量要高于愈傷組織，原因可能包括以下２方面：①在液體培養(yǎng)基中細胞的液質(zhì)接觸面大，營養(yǎng)成分可較快滲入細胞內(nèi)；②在液體培養(yǎng)中抑制細胞生長的代謝產(chǎn)物可較快釋放而作為合成次級代謝產(chǎn)物的前體；王俊麗［７，１５］等在研究杜仲愈傷組織和懸浮細胞的綠原酸的含量時也發(fā)現(xiàn)懸浮細胞綠原酸的含量要高于愈傷組織的含量，當培養(yǎng)條件合適時，懸浮細胞綠原酸的含量可接近杜仲葉的含量。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，杜仲培養(yǎng)過程中懸浮細胞黃酮和綠原酸的積累量也均高于愈傷組織，說明建立懸浮細胞培養(yǎng)系研究細胞生長和次生代謝產(chǎn)物積累規(guī)律對于植物細胞培養(yǎng)放大和提高次生代謝產(chǎn)物的得率具有重要意義，也是未來植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物發(fā)展的主要方向。 ［１］ 唐建軍，張祿源，何鳴筱．杜仲的研究與應(yīng)用進展［Ｊ］．植物學(xué)通報，１９９８，１５（６）：４７． ［２］ 黃勇，周吉源．杜仲愈傷組織的誘導(dǎo)及增殖效應(yīng)［Ｊ］．華中師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，２００３，３７（１）：１０２． ［３］ 李琰，王冬梅，崔宏安，等．不同因子對杜仲愈傷組織繼代培養(yǎng)的研究［Ｊ］．西北林學(xué)院學(xué)報，２００４，１９（１）：６１． ［４］ 李琰，董娟鵝，姜在民，等．杜仲愈傷組織中次生代謝產(chǎn)物積累動態(tài)研究［Ｊ］．西北植物學(xué)報，２００４，２４（１１）：２０３３． ［５］ 唐建軍，陳欣，志水勝好．培養(yǎng)條件對杜仲愈傷組織形成及次生代謝過程的影響［Ｊ］．浙江大學(xué)學(xué)報：工學(xué)版，２００２，３６（２）： １９３． ［６］ 李琰，張朝紅，馬希漢．培養(yǎng)基成分對杜仲愈傷組織生長及次生代謝產(chǎn)物含量的影響［Ｊ］．武漢植物學(xué)研究，２００４，２２（４）： ３５９． ［７］�。祝幔睿纾剩酰睿欤�，ＬｉａｏＸｉａｏｒｕ，ＣｈｅｎＰｉｌｉｎｇ，ｅｔａｌ．ＡｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃａｃｉｄｉｎｃｅｌｌｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｓｏｆＥｕｃｏｍｍｉａｕｌｍｏｉｄｅｓ ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌｌＴｉｓｓｕｅＯｒｇａｎＣｕｌｔ，２００３，７４：１９３． ［８］ 王亞琴，朱媛．杜仲細胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)桃葉珊瑚苷的研究［Ｊ］．廣西植物，２００７，２７（２）：２３６． ［９］ 邱曉芳，朱篤，張志斌，等．杜仲愈傷組織繼代培養(yǎng)基抑制褐化的研究［Ｊ］．食品科學(xué)，２００７，２８（８）：３０７． ［１０］ ＫａｚｕｈｉｋｏＭ，ＵｓａｍａＩＡ，ＹａｓｕｎｏｒｉＴ，ｅｔａｌ．ＡｇｇｒｅｇａｔｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｃａｌｌｕｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｗｏｏｄｙｐｌａｎｔＥｕｃｏｍｍｉａｕｌｍｏｉｄｅｓ［Ｊ］．ＢｉｏｃｈｅｍＥｎｇＪ，２００４，２１：１４９． ［１１］ 中國藥典．一部［Ｓ］．２０００：１７７． ［１２］ 中華人民共和國衛(wèi)生部藥典標準［Ｓ］．北京：人民衛(wèi)生出版社，２００３：１２６． ［１３］ 刑建民，趙德修，李茂寅，等．水母雪蓮懸浮培養(yǎng)細胞生長和黃酮類活性成分合成［Ｊ］．植物學(xué)報，１９９８，４０（９）：３６． ［１４］ 武利勤，郭順星，肖培根．新疆雪蓮細胞懸浮系的建立和黃酮類活性成分的產(chǎn)生［Ｊ］．中國中藥雜志，２００５，３０（１３）：９６５． ［１５］ 王俊麗，陳丕鈴，李會肖．杜仲愈傷組織中綠原酸的含量［Ｊ］．中國中藥雜志，１９９８，２３（６）：３３８． 杜仲提取物 綠原酸 金銀花提取物 苦杏仁苷 枇杷葉提取物-熊果酸 大花紫薇提取物-科羅索酸 上禾生物 專注植提 精于高純 基于您對天然產(chǎn)物需求持續(xù)創(chuàng)新 |
