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【摘要】  目的探討熊果酸(UA)對(duì)人高轉(zhuǎn)移卵巢癌細(xì)胞HO��8910黏附、運(yùn)動(dòng)和侵襲的影響。方法 以不同濃度的UA處理高轉(zhuǎn)移卵巢癌細(xì)胞HO��8910，采用MTT法及細(xì)胞黏附人工重組基底膜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)UA對(duì)HO��8910細(xì)胞的細(xì)胞毒作用及黏附能力的影響;Transwell小室法檢測(cè)UA對(duì)HO��8910細(xì)胞侵襲能力和趨化運(yùn)動(dòng)能力的影響。結(jié)果 不同濃度UA處理后，隨著UA濃度從10 μmol/L增加到30 μmol/L，與對(duì)照組比較，對(duì)細(xì)胞黏附抑制率增強(qiáng)(P<0.01)，能顯著降低HO��8910運(yùn)動(dòng)能力和侵襲能力(P<0.01)。結(jié)論 UA能抑制卵巢癌細(xì)胞HO��8910黏附、運(yùn)動(dòng)和侵襲能力。

【關(guān)鍵詞】  熊果酸;卵巢癌;侵襲

　　 熊果酸(UA)，屬于五環(huán)三萜類化合物，研究表明具有抗炎、護(hù)肝、降血脂等多種生物學(xué)活性。近年來研究發(fā)現(xiàn)UA具有多種抗腫瘤的作用〔1～3〕，但其是否通過抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移起抗腫瘤作用還未見報(bào)道，本研究旨在通過體外實(shí)驗(yàn)探討UA對(duì)卵巢腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響和機(jī)制。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料 人卵巢癌細(xì)胞株HO��8910引自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院研究所;UA、二甲基亞砜(DMSO )購自Sigma公司;RPMI��1640培養(yǎng)基、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、新生牛血清、胰蛋白酶購自杭州四季青生物工程公司;Transwell小室購自Costar公司;纖黏連蛋白購自Promega公司;Matrigel購自Becton Dickinson公司。

　　1.2 實(shí)驗(yàn)方法

　　1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞在含10%小牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI��1640的培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2孵箱中，細(xì)胞經(jīng)過消化傳代，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞待用。

　　1.2.2 增殖抑制實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期的HO��8910細(xì)胞，細(xì)胞以1×106/孔接種于96孔培養(yǎng)板中。將培養(yǎng)板放入37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后取出培養(yǎng)板，加入不同濃度UA，使其濃度分別為10、20、30、40、50 μmol/L，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行;同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組。培養(yǎng)板放回孵箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h，取出培養(yǎng)板，每孔加入MTT，培養(yǎng)板再放回孵箱孵育4 h。吸出上清液，加入200 μl二甲基亞砜。用酶標(biāo)儀測(cè)570 nm 波長處每孔的吸光度(A)值。計(jì)算增殖抑制率。增殖抑制率(%)=(對(duì)照組A值一處理組A值)/對(duì)照組A值×100%。

　　1.2.3 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn) 取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入無血清RPMI��1640 稀釋的Matrigel 膠溶液25 μl，37℃孵箱過夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次，室溫干燥1 h。每孔加入2%牛血清白蛋白(BSA)20 μl，置37℃孵箱1 h，PBS 沖洗2次，室溫干燥1 h。收集對(duì)數(shù)生長期的HO��8910細(xì)胞，懸浮于含0.1% BSA�睷PMI 1640培養(yǎng)基中，終濃度為6×108/L。用不同濃度UA預(yù)處理細(xì)胞24 h，使其終濃度分別為10、20、30 μmol/L，每孔加入預(yù)處理細(xì)胞100 μl，對(duì)照組加入等量的PBS，置孵箱內(nèi)1 h，棄去未黏附的細(xì)胞，MTT法測(cè)570 nm處測(cè)A值。每組設(shè)3個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按下式計(jì)算細(xì)胞黏附抑制率。 細(xì)胞黏附抑制率=(1-給藥組A 值/對(duì)照組A值)×100%。

1.2.4 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞侵襲重建基底膜實(shí)驗(yàn)在Transwell小室中進(jìn)行。在小室的聚碳酸濾膜PVPF膜的外表面涂趨化劑5 μg纖黏連蛋白，在膜的內(nèi)表面涂5 μg Matrigel。在24孔板內(nèi)加入0.1% BSA�睷PMI 1640，每孔600 μl。收集對(duì)數(shù)生長期的HO��8910細(xì)胞，懸浮于含0.1% BSA�睷PMI 1640培養(yǎng)基中，終濃度為1×109/L。將Transwell小室浸于24孔板的條件培養(yǎng)基中，每個(gè)小室加細(xì)胞懸液100 μl，再分別加入不同濃度UA，其濃度分別為10、20、30 μmol/L，對(duì)照組加入等量的PBS。37℃，5% CO2溫箱培養(yǎng)24 h。用棉簽擦盡膜的內(nèi)表面未穿過膜的細(xì)胞。隨機(jī)選擇5個(gè)400倍顯微視野，統(tǒng)計(jì)視野中侵襲至濾膜下表面的細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算平均值。按下式計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲的抑制率：抑制率=對(duì)照組平均侵襲細(xì)胞數(shù)-給藥組平均侵襲細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組平均侵襲細(xì)胞數(shù)×100%。

　1.2.5 細(xì)胞運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn) 聚碳酸濾膜內(nèi)表面不鋪Matrigel,其余操作同細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。按下式計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的抑制率：抑制率=對(duì)照組平均細(xì)胞數(shù)-給藥組平均細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組平均細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)用x±s表示，組間比較采用方差分析和SNK�瞦檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 UA對(duì)卵巢癌細(xì)胞株HO��8910細(xì)胞生長的抑制作用 MTT法結(jié)果表明，40、50 μmol/L UA處理細(xì)胞24 h及20～50 μmol/L UA處理細(xì)胞36、48 h后，明顯抑制HO��8910細(xì)胞的增殖(P<0.05;P<0.01)。10、20、30 μmol/L UA作用24 h，對(duì)HO��8910細(xì)胞的增殖的抑制作用無顯著差異(P>0.05)，見表1。

2.2 UA對(duì)卵巢癌細(xì)胞株HO��8910黏附能力的影響 10，20，30 μmol/L UA作用細(xì)胞24 h時(shí)，HO8910黏附能力分別為0.389±0.074，0.371±0.043和0.312±0.011，均顯著低于空白對(duì)照組(0.695±0.127)(P<0.01)，10，20，30 μmol/L UA組表1 UA對(duì)卵巢癌細(xì)胞株HO��8910細(xì)胞的生長抑制作用(x±s)

2.3 UA對(duì)卵巢癌細(xì)胞株HO��8910侵襲能力和運(yùn)動(dòng)能力的影響 結(jié)果如表2，圖1所示，不同濃度的熊果酸在體外作用24 h后可以顯著抑制HO��8910細(xì)胞的侵襲和細(xì)胞體外趨化運(yùn)動(dòng)能力，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較具有顯著性差異(P<0.01) 。表2 UA對(duì)卵巢癌細(xì)胞株HO��8910侵襲能力和趨化運(yùn)動(dòng)能力的影響(x±s)

3 討 論

卵巢癌是女性三大惡性腫瘤之一，盡管采用了腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和多種化療方案，但其5年生存率依然無明顯改善。惡性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移是引起腫瘤患者治療失敗和死亡的主要原因，腫瘤細(xì)胞首先通過膜表面受體黏附于由細(xì)胞間質(zhì)與基底膜組成細(xì)胞外基質(zhì)(ECM) 成分纖維黏連蛋白、層黏連蛋白和Ⅳ型膠原蛋白上，然后以蛋白酶降解基底膜和基質(zhì)，最后定向運(yùn)動(dòng)穿越ECM 破損處，侵入局部血管、淋巴管，最終在遠(yuǎn)離腫瘤原發(fā)生長部位的器官內(nèi)形成新侵襲、轉(zhuǎn)移灶。阻斷腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移是腫瘤治療的主要途徑。目前雖有一些抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的藥物在臨床上應(yīng)用，但效果不理想。

如何阻斷腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移，是目前治療腫瘤的熱點(diǎn)之一。UA廣泛存在于熊果、白花蛇舌草、女貞子、烏梅等天然植物和草藥中。研究表明，UA既能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，又能抑制正常細(xì)胞的惡變，還能干擾DNA 合成相關(guān)的酶;也可以通過堿性神經(jīng)脂酶介導(dǎo)的caspase 3，8，9 的激活來抑制細(xì)胞增殖，并能誘導(dǎo)其凋亡〔4，5〕。UA還可以抑制腫瘤血管形成、抗侵襲及增強(qiáng)免疫功能等多種機(jī)制來抑制腫瘤的生長和擴(kuò)散。本實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度UA處理24 h后，HO��8910細(xì)胞侵襲力、趨化運(yùn)動(dòng)及細(xì)胞黏附率，結(jié)果顯示，隨著UA濃度的增加，HO��8910細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞黏附明顯下降，表明UA能有效抑制HO��8910細(xì)胞黏附、遷移和侵襲，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。因此，UA作為一種分布廣、造價(jià)低廉的天然藥物，在腫瘤防治領(lǐng)域有良好的臨床應(yīng)用前景。

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