綠原酸人工抗原的合成及反應條件的優(yōu)化 | 綠原酸人工抗原的合成及反應條件的優(yōu)化 |
| 發(fā)布時間:2011-04-22 信息來源:admin 發(fā)布人:admin 點擊次數(shù):4385 |
［摘要］ 目的：制備中藥成分綠原酸（ＣＧＡ）的人工抗原，并優(yōu)化合成反應條件，為中藥注射劑不良反應的深入研究提供物質基礎和技術基礎。方法：采用碳二亞胺法，將ＣＧＡ與載體蛋白牛血清白蛋白（ＢＳＡ）偶聯(lián)起來制得完全抗原（ＣＧＡＢＳＡ）；正交法優(yōu)化合成反應條件；經基質輔助激光解吸飛行時間質譜（ＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ）和紫外吸收光譜（ＵＶ）測定其偶聯(lián)率（Ｍｒ）。結果：ＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ和ＵＶ測得合成的人工抗原ＣＧＡＢＳＡ的Ｍｒ分別為２０和１８８；反應最佳條件為ＮＨＳ，ＥＤＣ，ＢＳＡ與ＣＧＡ的比率為４∶１，１∶１，１∶２００，ｐＨ為９。結論：成功合成了綠原酸全抗原（ＣＧＡＢＳＡ），為進一步深入研究綠原酸的過敏原性及其相關性研究提供物質基礎。 ［關鍵詞］ 綠原酸；基質輔助激光解吸飛行時間質譜；完全抗原 中藥注射液不良反應主要為Ｉ型變態(tài)反應，變態(tài)反應相對較多地出現(xiàn)在清熱解毒類的中藥注射劑中，首先與這些品種較高的臨床應用率是相關的，其次跟它們共有的內在主要成分綠原酸（ＣＧＡ）是否相關，是否是其致敏原的問題，越來越受到關注和重視，值得筆者深入探討。ＣＧＡ在眾多的中藥注射劑如雙黃連注射液、茵梔黃注射液、銀黃注射液、清開靈注射液等中均存在，具有抗菌、抗病毒、利膽等作用，是中藥抗感染類注射劑的有效成分之一。由于ＣＧＡ是植物次生代謝產物，在植物中廣泛分布，從厥類植物到高等雙子葉植物均有報道，且其極性較大，水溶性較好，雖然ＣＧＡ在一些注射劑中不是活性成分，但工藝中有可 能未將其除去而含有ＣＧＡ［１］。從ＣＧＡ的結構、存在形式、理化性質分析，存在致敏的可能。相對分子質量低于１０００的化合物，可以與蛋白質結合形成半抗原載體復合物，有人認為，以ＣＧＡ為代表的鄰苯二羥基類成分是半抗原物質，經一定反應，與蛋白質的結合后具有致敏性；１５～１８分子或４０分子的ＣＧＡ（２種反應機制）與１分子人類血清蛋白結合，成為具有高度抗原性的結合物［２４］，也有研究者認為，綠原酸不具有致敏作用［５６］。雖然ＣＧＡ是否為變應原尚無確切定論，但凡是含有ＣＧＡ且供靜脈滴注用的中藥注射劑，容易發(fā)生過敏反應，卻是不爭的事實。 本研究通過制備ＣＧＡ與蛋白的結合物，即合成綠原酸全抗原（ＣＧＡＢＳＡ），設計討論其反應條件的優(yōu)化；并采用紫外光譜和基質輔助激光解吸飛行時間質譜（ＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ）測定其偶聯(lián)率（Ｍｒ），為進一步深入研究中藥注射劑不良反應（主要是Ｉ型變態(tài)反應）的相關性基礎研究提供物質基礎。 １ 材料與方法 １．１ 試劑與儀器 ＣＧＡ（純度≥９８.０％，北京化學試劑公司）；牛血清白蛋白（ＢＳＡ，北京索萊寶科技有限公司）；碳二亞胺鹽酸鹽（ＥＤＣ·ＨＣＬ純度≥９９.０％，北京化學試劑公司）；Ｎ羥基琥珀酰亞胺（ＮＨＳ）；二甲基甲酰胺（ＤＭＦ）均為分析純，北京化學試劑公司；磷酸鹽緩沖液（ＰＢＳ，ｐＨ７.２，０.０１ｍｏｌ·Ｌ１）；ＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ（美國布魯克道爾頓有限公司）；紫外可見分光光度計（ＵＮＩＣＯ２８００，美國）。 １．２ ＣＧＡＢＳＡ合成方法ＣＧＡＢＳＡ人工抗原的合成參照文獻［７］方法進行，ＣＧＡ １７.０ｍｇ，ＥＤＣ· ＨＣＬ４２.０ｍｇ，ＮＨＳ１８.０ｍｇ，溶解于３ｍＬＤＭＦ中，避光密封，室溫反應２４ｈ后得Ａ液；ＢＳＡ５０.０ｍｇ溶于７ｍＬＰＢＳ中為Ｂ液。然后將Ａ液逐滴加入Ｂ液中，密封避光４℃下攪拌過夜；上述反應完成后，反應液轉移至透析袋于４℃攪拌下用ＰＢＳ透析３ｄ；經凍干處理，即得到ＣＧＡＢＳＡ復合物，于－２０℃保存?zhèn)溆煤铣陕肪�見圖１。
１．３ 合成條件的優(yōu)化 分析影響合成的所有因素，確定其主要因素有ＮＨＳ，ＥＤＣ及ＢＳＡ與ＣＧＡ的比例（摩爾比），以及反應體系的ｐＨ，設計Ｌ９（３４）的正交試驗表進行試驗。 １．４�。茫牵联玻拢樱寥斯た乖悸�(lián)率的計算 １．４．１ 基質輔助激光解吸飛行時間質譜（ＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ）［８］ 供試品處理：稱�。茫牵联玻拢樱粒蔼保叮恚�，溶于８ｍｏｌ·Ｌ－１的尿素３０μＬ中，然后將它稀釋成適當?shù)臐舛取７Q�。拢樱粒豹保埃恚缛苡谒担唉蹋��；|輔助溶液的配制：將０１５％ＴＦＡ３４μＬ加到乙腈１７μＬ中，再加入適量的芥子酸使溶液達到過飽和狀態(tài)，超聲１５ｍｉｎ，１０００ｒ· ｍｉｎ－１離心３ｍｉｎ，備用。 ＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ測定：各取供試品和基質輔助溶液１μＬ，充分混勻，吸取混合液１μＬ滴加在金屬點樣板上，室溫涼干后，上ＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ測定。 ＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ的儀器工作條件為：Ｎ２激光３３７ｎｍ，４次／ｓ脈沖，加速電壓２０ｋＶ，真空度５×１０－９ＫＰａ，真空管長度為１５ｍ，線性模式下操作，所得數(shù)據用ＢｒｕｋｅｒＸＭＡＳＳ軟件分析。 １．４．２ 紫外吸收光譜法 制備不同質量濃度 （３２，６４，１２８，２５６，５１２ｍｇ·Ｌ－１）ＣＧＡ對照品溶液，在２７８ｎｍ處測定紫外吸收值，得回歸方程。 對偶聯(lián)物（２００ｍｇ· Ｌ－１），ＢＳＡ對照品溶液（２００ｍｇ· Ｌ－１）進行紫外掃描，水為對照。ＣＧＡＢＳＡ為２００ｍｇ·Ｌ－１，在２７８ｎｍ處吸收值為Ａ１，ＢＳＡ為２００ｍｇ·Ｌ－１時，在２７８ｎｍ處的吸收值為Ａ２，那么Ａ１～Ａ２則是ＣＧＡ在此波長處的貢獻。根據回歸方程可得出偶聯(lián)物中對應的ＣＧＡ的質量濃度，根據公式即可計算出Ｍｒ。
２ 結果 ２．１�。茫牵联玻拢樱寥斯た乖模停粒蹋模瑟玻裕希篇玻停予b定圖２和圖３分別為ＢＳＡ和ＣＧＡＢＳＡ的質譜圖�？芍拢樱恋南鄬Ψ肿淤|量為６６２９８，ＣＧＡＢＳＡ 的相對分子質量為７３５３８，已知ＣＧＡ的相對分子質量為３５４，該結果表明ＣＧＡＢＳＡ中，每個載體蛋白ＢＳＡ分子上偶聯(lián)有２０個［（７３５３８－６６２９８）／３５４≈２０］ＣＧＡ分子，人工抗原的合成成功可用于進行相應的變態(tài)反應基礎研究。
２．２ ＣＧＡＢＳＡ人工抗原的紫外分析不同濃度ＣＧＡ對照品溶液在２７８ｎｍ處的紫外吸收值，以質量濃度Ｃ（ｍｇ·Ｌ－１）為橫坐標，吸光度Ａ為縱坐標，計算回歸方程。結果表明ＣＧＡ在３.２～５１.２ｍｇ·Ｌ－１的紫外吸收值與濃度有很好的線性關系，回歸方程為Ａ＝０.０２５３Ｃ－０００１２，ｒ＝０.９９９９。 合成的ＣＧＡＢＳＡ人工抗原Ａ１ ＝０６３０，ＢＳＡＡ２＝０.１０６，根據公式Ａ１－Ａ２＝０.５２４，根據回歸方程Ａ＝０.０２５３Ｃ－０.００１２，ｒ＝０.９９９９，可得出偶聯(lián)物中對應的ＣＧＡ的質量濃度２０.７ｍｇ·Ｌ－１，得出Ｍｒ約為１８.８（１８.８∶１）。 ２．３ 抗原合成條件的優(yōu)化結果 從研究數(shù)據得出，無論ＥＤＣ與ＣＧＡ比例是１∶１，２∶１還是４∶１，其中的ＥＤＣ都是等量或充分過量的，ＣＧＡ幾乎可以完全反應，所以對反應的影響最小；ＮＨＳ與ＣＧＡ的比例增加，Ｍｒ也在增加；本實驗中ｐＨ為９時，Ｍｒ的范圍均在理想的推薦范圍（５∶１～２０∶１），確定反應體系的最佳ｐＨ為９。 ３ 討論 國內外對ＣＧＡ的研究主要集中在藥效學研究，而對ＣＧＡ致敏性的研究，國外研究集中在２０世紀６０年代，加拿大的Ｆｒｅｅｄｍａｎ研究小組和美國的Ｌａｙｔｏｎ研究小組對ＣＧＡ的致敏性進行了研究，并在此期間發(fā)表了系列文獻，他們對于ＣＧＡ是否為變應原呈相反的兩方面意見，前者認為是變應原，而后者認為不是變應原。對上述２個小組的研究文獻綜合分析，對于ＣＧＡ是否為變應原尚無確切定論。缺乏系統(tǒng)的試驗；受試物的純度問題；試驗方法不同等，可能是導致雙方結果不一致的原因［３，６］。以后對此問題基本無報道，國內則無相關報道。 ＣＧＡ是一種羧基半抗原，相對分子質量為３５４.３０，低于１０００，本身并不具備免疫原性，必須將其與具有免疫原性的載體蛋白相偶聯(lián)生成完全抗原［９］。本研究將綠原酸（ＣＧＡ）與載體牛血清白蛋白（ＢＳＡ）偶聯(lián)，制備ＣＧＡ與蛋白的結合物，即合成綠原酸全抗原（ＣＧＡＢＳＡ），為觀察ＣＧＡＢＳＡ的致敏作用提供物質基礎，確定ＣＧＡ是否為變應原。 對于羧基半抗原與載體的偶聯(lián)，傳統(tǒng)的人工抗原的合成方法有混合酸酐法、活潑酯法及碳二亞胺法。本實驗采用碳二亞胺法合成ＣＧＡＢＳＡ，由于ＣＧＡ分子結構中的羧基可用于偶聯(lián)反應，采用碳二亞胺法合成方案的優(yōu)點是可以避免載體蛋白自身的氨基和羧基在交聯(lián)劑作用下發(fā)生的自身交聯(lián)，從而最大程度地減少反應副產物的生成促進劑，偶聯(lián)效果較好。 然而，抗原的免疫原性不僅與抗原的分子結構大小有關，還與半抗原與載體蛋白偶聯(lián)率的大小有關。連接過多的半抗原，并不意味著實際的免疫效果就一定好，半抗原與載體的偶聯(lián)比（Ｍｒ）存在著最佳范圍（５∶１～２０∶１）［１０］，為得到理想偶聯(lián)率的高免疫原性全抗原，筆者對合成條件進行了的多次優(yōu)化試驗。本實驗中，反應中ｐＨ的變化會使反應中蛋白質不穩(wěn)定產生沉淀析出，ＮＨＳ直接影響取代從而影響蛋白質和抗原的連接，結合反應中出現(xiàn)的現(xiàn)象及實驗數(shù)據分析，ＮＨＳ的量和ｐＨ是影響偶聯(lián)率的重要因素，因此，４個影響因素作用的大小順序是ＮＨＳ與ＥＤＣ的比＞反應的ｐＨ＞ＣＧＡ與ＢＳＡ的比＞ＥＤＣ與ＣＧＡ的比。筆者認為本反應的最佳條件是：ＮＨＳ，ＢＳＡ，ＥＤＣ與ＣＧＡ的比分別為４∶１，１∶２００和１∶１及反應的ｐＨ為９，以此條件合成的ＣＧＡＢＳＡ，其半抗原與載體蛋白的結合比從２∶１升高至１４∶１。 此外，本實驗采用ＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ測定人工抗原ＣＧＡＢＳＡ的Ｍｒ，與傳統(tǒng)的鑒定方法紫外光譜掃描法進行了比較，ＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ技術具有高靈敏度，供試品消耗量低，結果直觀、準確（誤差小于０２％）的優(yōu)點，現(xiàn)有紫外光譜掃描法對ＣＧＡＢＳＡ復合物的測定，操作較簡單易行、但所需樣品量多，誤差也較大；結果表明２種方法測得的數(shù)據比較接近，但是ＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ結果更為精確、可信。 ＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ法是比較理想的用于生物大分子的鑒定分析方法［８］。 本研究合成效率較高，合成方法簡便可行，為進一步對ＣＧＡ的致敏性及其發(fā)生機制、毒理學進行系統(tǒng)深入的研究，為尋找合適、敏感的方法對中藥注射劑變態(tài)反應的研究提供了物質基礎，也可為其他小分子物質的人工抗原合成提供參考。 ［參考文獻］ ［１］ 賴宇紅，陳浩桉，楊衛(wèi)榮．中藥注射劑變態(tài)反應研究亟待加強［Ｊ］．中藥新藥與臨床藥理，２００２，１３（５）：３２４． ［２］�。疲颍澹澹洌恚幔睿樱希粒睿簦椋纾澹睿椋悖穑颍铮穑澹颍簦椋澹螅铮妫悖瑁欤铮颍铮纾澹睿椋悖幔悖椋洌郏剩荩剩粒欤欤澹颍纾茫欤椋睿桑恚恚酰睿铮欤保梗叮�，３５：９７． ［３］�。疲颍澹澹洌恚幔睿樱希澹簦幔欤茫瑁欤铮颍铮纾澹睿椋悖幔悖椋洌海幔睿幔欤欤澹颍纾澹睿椋睿纾颍澹澹睿悖铮妾玻妫澹睿猓澹幔睿郏剩荩危幔簦酰颍�，１９６１，１９２：２４１． ［４］ 楊慧，劉志剛，韓慶國，等．艾蒿、青蒿花粉變應原組分的研究 ［Ｊ］．免疫學雜志，２００４，２０（２）：１２０． ［５］�。蹋幔簦铮睿蹋蹋茫幔螅簦铮颍猓澹幔睿幔欤欤澹颍纾幔螅瑁穑澹颍螅澹睿螅椋簦椋觯椋簦簦铮簦瑁澹螅穑酰颍纾澹� （Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）：ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｏｎｔｏｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃａｃｉｄｉｎｐｒｉｍａｒｙａｌｌｅｒｇｙｔｏｃａｓｔｏｒｂｅａｎ［Ｊ］．ｌｎｔＡｒｃｈＡｌｌｅｒｇｙ，１９６３，２３：２２５． ［６］�。蹋幔簦铮睿蹋蹋危铮睿洌椋妫妫酰螅椋猓欤澹幔欤欤澹颍纾澹睿椋悖悖铮睿簦幔恚椋睿幔睿簦椋螅铮欤幔簦澹洌妫颍铮恚螅幔恚穑欤澹螅铮妫悖瑁欤铮颍铮纾澹睿椋悖幔悖椋洌悖幔酰螅椋睿纾幔欤欤澹颍纾椋悖颍澹幔悖簦椋铮睿海校酰颍澹悖瑁欤铼玻颍铮纾澹睿椋悖幔悖椋洌睿铮簦幔睿幔欤欤澹颍纾澹睿郏剩荩剩粒欤欤澹颍纾保梗叮�，３５（５）：２６８ ［７］ 孫武勇，劉向輝，屈凌波，等．阿莫西林完全抗原的合成與鑒定［Ｊ］．鄭州大學學報，２００７，４２（１）：７２． ［８］ 蔡碧雙，邵幼巖，林紀昀，等．甘草酸人工抗原的合成鑒定及免疫原性分析［Ｊ］．中國生化藥物雜志，２００８，２９（１）：１９． ［９］ 余若禎，何苗，施漢昌，等．２，４Ｄ完全抗原的合成及其免疫性能評價［Ｊ］．環(huán)境科學，２００６，２７（１）：１４６． ［１０］ 楊利國，胡少昶，魏平華，等．酶免疫測定技術［Ｍ］．南京：南京大學出版社，１９９８：２８０．
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