酯化修飾對(duì)二氫楊梅素性能的影響 | 酯化修飾對(duì)二氫楊梅素性能的影響 |
| 發(fā)布時(shí)間:2011-04-27 信息來源:admin 發(fā)布人:admin 點(diǎn)擊次數(shù):4443 |
摘 要：用月桂酰氯對(duì)二氫楊梅素進(jìn)行不同程度的酯化修飾，探討不同程度的酯化修飾對(duì)二氫楊梅素溶解性和抗氧化性能的影響。結(jié)果表明：與二氫楊梅素相比，二氫楊梅素酯化物在油中的溶解度提高20～300 倍，并且隨著酯化程度加大，二氫楊梅素酯化物在油中溶解度增加。二氫楊梅素酯化物在極性溶劑中清除DPPH 自由基和H2O2 的能力比二氫楊梅素低，酯化物的抗氧化活性隨著酯化程度的增加呈下降趨勢(shì)；在鐵離子- 抗壞血酸誘導(dǎo)的卵磷脂過 氧化反應(yīng)體系中，二氫楊梅素酯化物的抗氧化活性明顯優(yōu)于二氫楊梅素，且不受酯化程度的影響，表明二氫楊梅素及其酯化物在卵磷酯脂質(zhì)體中的抗氧化活性受溶解性和羥基數(shù)目雙重影響。 關(guān)鍵詞：二氫楊梅素；月桂酰氯；酯化反應(yīng)；溶解性；抗氧化活性 二氫楊梅素(dihydromyricetin，DMY)是一種重要的黃酮類化合物，化學(xué)名稱為3, 5 ,7, 3,4, 5- 六羥基黃烷酮醇[1]，其分子以2- 苯基苯并吡喃環(huán)為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，有6 個(gè)取代羥基，賦予其特殊的生理功能[2]。二氫楊梅素的生理功效主要表現(xiàn)在抗氧化[3-5]、抗菌抑菌[6-7]、防紫外線輻射[8-9]、促進(jìn)細(xì)胞增殖[10]、保肝護(hù)肝[11-12]、抗腫瘤[13] 等方面，研究表明， 二氫楊梅素的這些功能與其清除自由基的抗氧化性能密切相關(guān)。 將二氫楊梅素的羥基進(jìn)行酯化可以改善其脂溶性，提高其在油脂體系中的抗氧化活性[ 14 ]。但是，羥基數(shù)的減少會(huì)導(dǎo)致二氫楊梅素分子自身抗氧化活性降低[15]。因?yàn)辄S酮類化合物在抗氧化過程中，主要是通過羥基與自由基反應(yīng)生成較穩(wěn)定的半醌式自由基，從而終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[16]。為探討分子修飾對(duì)二氫楊梅素性能的影響， 本實(shí)驗(yàn)用月桂酰氯對(duì)二氫楊梅素進(jìn)行不同程度的酯化修飾，從產(chǎn)物溶解性及在不同氧化體系中產(chǎn)物抗氧化活性的變化方面，研究分子修飾對(duì)二氫楊梅素性質(zhì)的影響，為揭示二氫楊梅素分子結(jié)構(gòu)與活性之間的關(guān)系提供參考。 1 材料與方法 1.1 材料與試劑 藤茶，福建武夷山產(chǎn)，經(jīng)鑒定為原植物；N,N- 二甲基甲酰胺、月桂酰氯、碳酸鈉均為分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。 1.2 儀器與設(shè)備 UV1700紫外-可見光譜儀日本島津公司；TENSOR27傅里葉變換紅外光譜儀 德國(guó)Bruker 光譜儀器公司。 1.2 方法 1.2.1 制備二氫楊梅素 稱取100g 藤茶，加2L 去離子水，加熱至沸，小火煮30～60min。趁熱過濾，將濾液自然冷卻到室溫，靜置沉淀24h 以上。抽濾，濾渣在55℃下干燥，得二氫楊梅素粗品。將二氫楊梅素粗品用水重結(jié)晶5 次以上，得到純度為95% 的二氫楊梅素。 1.2.2 制備二氫楊梅素月桂酸酯 將自制純度為95%的二氫楊梅素溶解于N,N- 二甲基甲酰胺，加入一定量催化劑。攪拌下緩慢滴加一定物質(zhì)量配比的月桂酰氯于反應(yīng)體系。滴加完畢后，于40℃、攪拌下反應(yīng)24～36h，反應(yīng)過程中取樣分析二氫楊梅素轉(zhuǎn)化率。反應(yīng)完畢后，用1g/100mL Na2CO3 水溶液洗去反應(yīng)體系的酸性物質(zhì)，用熱水洗去未反應(yīng)的二氫楊梅素及其他殘留雜質(zhì)，最后用冰水沖洗數(shù)次。將產(chǎn)品真空干燥，得到黃綠色或黃色蠟狀物。紫外- 可見光譜掃描產(chǎn)品的光譜特性，紅外光譜分析產(chǎn)品結(jié)構(gòu)。 1.2.3 溶解度測(cè)定 在250mL 錐形瓶中加入色拉油50g 或100g 水，定量添加二氫楊梅素及其月桂酸酯化物，在45～50℃的水浴振蕩器中振蕩1h 后靜置10h，觀察溶解情況。若完全溶解則繼續(xù)添加，直至有不溶物出現(xiàn)，離心除去不溶物。水中不溶物直接干燥后稱質(zhì)量。油中不溶物先用溫水洗，將表面油洗掉，然后干燥，稱質(zhì)量。添加量減去不溶物量，即為溶解的質(zhì)量。 1.2.4 DPPH 自由基清除實(shí)驗(yàn) 將二氫楊梅素及其月桂酸酯化物溶解于乙醇中，配成與二苯代苦味酰自由基(DPPH)溶液相同濃度，量取2.0mL樣品液，滴加0.2mmol/L DPPH 乙醇溶液2.0mL，放置30min，以乙醇為空白，分別測(cè)定517nm 波長(zhǎng)處吸光度。 按照公式(1) 計(jì)算自由基清除率(RIC)。
式中：A1 為空白樣吸光度；A2 為2mL 待測(cè)試液與2mL 乙醇混合液吸光度；A3 為2mL DPPH 溶液與2mL 乙醇混合液吸光度。 1.2.5 清除H2O2 的實(shí)驗(yàn) 將二氫楊梅素及其月桂酸酯化物分別用乙醇配制成0.01mol/L 樣品液。準(zhǔn)確吸取樣品液l.0mL，加入0.25mLl.0mol/L H2SO4 和5mL 0.25mol/L H2O2 水溶液，室溫下反應(yīng)10min，再加入10% KI 溶液20mL，暗處靜置5min。用0.05mol/L Na2S2O3 滴定，以1%～2% 淀粉溶液指示終點(diǎn)測(cè)定I2 含量。按照公式(2)計(jì)算抗氧化值(AOV)。
式中：V0 為空白樣消耗的Na2S2O3 體積/mL；V 為樣品消耗的Na2S2O3 體積/mL；c 為Na2S2O3 的濃度/(mol/L)。 1.2.6 抑制脂質(zhì)過氧化活性的測(cè)定 脂質(zhì)體分散系(LLS)配制：稱取300mg 卵磷脂，溶解于30mL pH7.4 的磷酸緩沖溶液中(10mmol/L)，冰浴中振蕩，使卵磷脂均勻分散于緩沖溶液中；三氯醋酸(TCA)- 硫代巴比妥酸(TBA)- 鹽酸(HCl)混合液配制：稱取15g TCA、0.375g TBA，依次放入100mL 水中，滴 加2.1mL 濃鹽酸于其中。 測(cè)定步驟：于樣品管中依次加入1.0mL卵磷脂溶液(LLS)、1.0mL 400μmol/L 的三氯化鐵溶液、1.0mL 400μmol/L 抗壞血酸和1.2.4 節(jié)配制的樣品乙醇液1.0mL，于37℃水浴放置60min，再加入2.0mL TCA-TBA-HCl 混合液，在90～100℃水浴中放置15min 后取出，迅速冷卻，以2000r/min 轉(zhuǎn)速離心10min，取上清液在535nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。空白管以1.0mL 蒸餾水代替1.0mL 樣品，操作方法同樣品管，測(cè)定空白管的吸光度。按照公式( 3 )計(jì)算抑制脂質(zhì)過氧化的抑制率(LIC)。
式中：As 為上清液的吸光度；Ac 為空白管的吸光度。 2 結(jié)果與分析 2.1 紫外- 可見光譜分析 由圖1 可知，二氫楊梅素在291nm 波長(zhǎng)處有特征吸收峰，月桂酸在247nm 波長(zhǎng)有吸收峰，而二氫楊梅素月桂酸酯在291nm 波長(zhǎng)處沒有吸收峰，但在244nm 和282nm 波長(zhǎng)處有吸收峰，此外酯化物在336nm 波長(zhǎng)處有一較小吸收峰，而二氫楊梅素及月桂酸在此處均沒有吸收峰。所以，從紫外吸收峰的變化可以初步判定產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)與二氫楊梅素是不同的。
2.2 紅外光譜圖分析
由圖2 可知，在2850cm-1 和2920cm-1 處，二氫楊梅素月桂酸酯和月桂酸均有兩個(gè)相連的吸收峰而二氫楊梅素分子無此吸收峰。這兩處的峰是脂肪鏈的C － H 鍵伸縮振動(dòng)吸收峰，即亞甲基的特征吸收峰，說明二氫楊梅素分子中已引入月桂酸脂肪鏈烴。二氫楊梅素酯化物在1770cm-1 處有吸收峰，此處為芳香族化合物羥基酯化后的酯鍵羰基的伸縮振動(dòng)吸收峰。二氫楊梅素酯化物在1770cm-1 處的吸收峰可充分證明二氫楊梅素的羥基已與月桂酰氯發(fā)生了酯化反應(yīng)。 2.3 二氫楊梅素及其酯化物在油和水中的溶解性
二氫楊梅素屬于雙氫黃烷酮醇，為非平面型分子，分子間排列不緊密，分子間引力比平面型分子小，所以有利于水分子的進(jìn)入。此外，二氫楊梅素含有6 個(gè)親水性羥基，親水基團(tuán)可以通過氫鍵結(jié)合的方式與水分子產(chǎn)生相互作用，使二氫楊梅素分子發(fā)生溶劑化或增溶作用。因此，二氫楊梅素在水中特別是在熱水中具有較好的溶解性。當(dāng)分子中引入疏水性的長(zhǎng)鏈脂肪烴后，由于疏水基團(tuán)與水分子產(chǎn)生斥力，會(huì)極大地降低其在水相中的溶解性，同時(shí)增大其在油相中的溶解性。由表1 可知，二氫楊梅素經(jīng)過月桂酰氯酯化后，在水中的溶解度下降很多，均難溶于水。而在油中的溶解度提高了20～300 倍，并且隨著�；瘎┰龃蠹歹セ潭鹊募哟螅セa(chǎn)物在油中的溶解度也隨之加大。 2.4 抗氧化活性 2.4.1 清除DPPH 自由基能力
2- 苯基苯并吡喃環(huán)和羥基是二氫楊梅素分子抗氧化作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。其中，2 - 苯基苯并吡喃環(huán)是抗氧化作用的結(jié)構(gòu)依托，羥基是抗氧化作用的結(jié)合位點(diǎn)[2]。二氫楊梅素A 環(huán)上的碳原子與酚羥基及C 環(huán)上的氧原子形成大π鍵，電子分散于整個(gè)大π鍵體系中。同理，B環(huán)上的碳原子與B 環(huán)酚羥基的氧原子形成另一大π鍵。酚羥基的電子偏向共振π鍵，削弱了O － H 鍵，使質(zhì)子H 易脫去成為氫供體，從而發(fā)揮其抗氧化作用。脫去H 的二氫楊梅素成為苯氧自由基，由于苯氧自由基氧原子上的不成對(duì)電子分散于整個(gè)共軛體系，使參與共軛的原子電荷分布均勻，成為穩(wěn)定的自由基，終止了其進(jìn)一步參與自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。由圖3 可知，隨著月桂酰氯加入量的提高，二氫楊梅素酯化物對(duì)于DPPH 自由基清除率呈下降趨勢(shì)。原因是游離羥基數(shù)目相應(yīng)減少導(dǎo)致了其清除自由基能力的下降。 2.4.2 對(duì)H2O2 的清除能力 H2O2 是一種強(qiáng)氧化劑，在體內(nèi)可誘發(fā)轉(zhuǎn)變?yōu)榱u自由基，使多種類型的細(xì)胞發(fā)生凋亡。 由圖4 可知，二氫楊梅素酯化物清除H2O2 能力比二氫楊梅素差，并且隨著酯化程度的增加，清除H2O2 的能力呈下降趨勢(shì)。這說明羥基是二氫楊梅素抗氧化活性的主要基團(tuán)，羥基數(shù)目越多，可提供的氫原子越多，抗氧化活性越強(qiáng)。 2.4.3 抗脂質(zhì)過氧化活性
由圖5 可知，在鐵離子- 抗壞血酸誘導(dǎo)的卵磷脂過氧化反應(yīng)體系中，二氫楊梅素酯化物的抗氧化活性顯著優(yōu)于二氫楊梅素。卵磷脂C2 上的脂溶性自由基位于雙分子層的疏水區(qū)，二氫楊梅素分子中引入月桂酸鏈烴后，脂溶性增強(qiáng)，分子可以很容易伸入到卵磷脂雙分子層的疏水區(qū)與脂溶性自由基接觸，達(dá)到清除脂溶性自由基目的。而二氫楊梅素難以進(jìn)入卵磷脂雙分子層疏水區(qū)，不能與脂溶性自由基進(jìn)行很好接觸，導(dǎo)致其抑制脂質(zhì)過氧化的能力不如酯化物。所以，介質(zhì)微環(huán)境可以對(duì)物質(zhì)的抗氧化活性產(chǎn)生重要作用。二氫楊梅素的酯化程度對(duì)其抗氧化活性影響不明顯，這可能是因?yàn)槠淇寡趸钚允艿椒肿又辛u基數(shù)目和分子溶解性雙重作用的影響。 3 結(jié)論 通過對(duì)二氫楊梅素進(jìn)行分子修飾及比較二氫楊梅素與其分子修飾產(chǎn)物在不同體系中的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)二氫楊梅素及其酯化物的抗氧化能力與其所處體系密切相關(guān)。在DPPH 自由基清除實(shí)驗(yàn)和清除H2O2 實(shí)驗(yàn)中，二氫楊梅素酯化物的抗氧化活性比二氫楊梅素低，并且隨著酯化程度的加大，酯化物的抗氧化性能呈下降趨勢(shì)。 所以，在極性溶劑體系二氫楊梅素及其酯化物的抗氧化活性受分子中羥基數(shù)目的影響較大；在鐵離子- 抗壞血酸誘導(dǎo)的卵磷脂過氧化反應(yīng)體系中，二氫楊梅素酯化物的抗氧化活性明顯優(yōu)于二氫楊梅素，并且不受酯化程度的影響，說明二氫楊梅素及其酯化物在脂質(zhì)體中的抗氧化活性受溶解性和羥基數(shù)雙重影響。 參考文獻(xiàn)： [1] ZHANG Yansong, ZHANG Qingying, LI Liying, et al. Simultaneous determination and pharmacokinetic studies of dihydromyricetin and myricetin in rat plasma by HPLC-DAD after oral administration of Ampelopsis grossedentata decoction[J]. Journal of Chromatography B,2007, 860: 4-9. [2] 李衛(wèi), 鄭成, 寧正祥, 等. 二氫楊梅素的酯化及其抗氧化規(guī)律探討[J].食品科技, 2007(5): 198-201. [3] MA J, YANG H, BASILE M J, et al. Analysis of polyphenolic antioxidants from the fruits of three pouteria species by selected ion monitoring liquid chromatography-mass spectrometry[J]. J Agric Food Chem, 2004,52(19): 5873-5878. [4] GAO Jianhua, LIU Benguo, NING Zhengxiang, et al. Characterization and antioxidant activity of flavonoid-rich extracts from leaves of Ampelopsis grossedentata[J]. Journal of Food Biochemistry, 2009, 33:808-820. [5] MA J, LUO X D, PROTIA P, et al. Bioactive novel polyphenols from the fruit of Manilkara zavessela (Sapodilla)[J]. J Nat Prod, 2003, 66(7):983-986. [6] HAYASHI T, TAHARA S, OHGUSHI T. Genetically-controlled leaf traits in two chemotypes of Salix sachalinensis Fr. Schm (Salicaceae)[J].Biochem Syst Ecol, 2005, 33:7-38. [7] ROSCHEK B Jr, FINK R C, McMICHAEL M D, et al. Elderberry flavonoids bind to and prevent H1N1 infection in vitro[J]. Phytochemistry,2009, 70: 1255-1261. [8] LAVOLA A, APHALO P J, LAHTI M, et al. Nutrient availability and the effect of increasing UV-B radiation on secondary plant compounds in Scots pine[J]. Environ Exp Bot, 2003, 49(1): 49-60. [9] RIITTA T, TIMO V, PEDRO J A, et al. Clonal differences in growth and phenolics of willows exposed to elevated ultraviolet-B radiation[J].Basic Appl Ecol, 2003, 4(3): 219-228. [10] TOWATARI K, YOSHIDA K, MORI N, et al. Polyphenols from the heartwood of Cercidiphyllum japonicum and their effects on proliferation of mouse hair epithelial cells[J]. Planta Med, 2002, 68: 995-998. [11] MURAKAMI T, MIYAKOSHI M, ARAHO D, et al. Hepatoprotective activity of tocha, the stems and leaves of Ampelopsis grossedentata, and ampelopsin[J]. Biofactors, 2004, 21(1/4): 175-178. [12] YABE N, TANAKA K, MATSUI H. An ethanol-extract of Ampelopsis brevipedunculata (Vitaceae) berries decreases ferrous iron-stimulated hepatocyte injury in culture[J]. J Ethnopharmacology, 1998, 59(3): 147-159. [13] 蔣才武, 李炳超, 唐乾利. 雙氫楊梅素與G- 四鏈體的相互作用研究[J]. 化學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 65: 2159-2162. [14] 李衛(wèi), 鄭成, 寧正祥. 二氫楊梅素月桂酸酯在豬油中的抗氧化性研究[J]. 食品科學(xué), 2005, 26(9): 73-76. [15] 郭清泉, 林淑英, 李大光, 等. 二氫楊梅素抗氧化機(jī)制探討[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(5): 121-123. [16] 張紅雨. 黃酮類抗氧化劑結(jié)構(gòu)活性關(guān)系的理論解釋[J]. 中國(guó)科學(xué): B輯, 1999, 29(1): 91-96.
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