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【摘要】  目的研究楊梅素分散片對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性腦缺血的保護(hù)機(jī)制及對(duì)血栓形成的影響。方法采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法制備大鼠實(shí)驗(yàn)性全腦缺血再灌注損傷模型，通過(guò)測(cè)定大鼠腦含水量，超氧化物歧化酶（SOD）、單胺氧化酶(MAO)的活性和丙二醛(MDA)、乳酸(LA)的含量，觀察楊梅素分散片對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性腦缺血的影響；采用體內(nèi)靜脈血栓形成法,觀察楊梅素分散片對(duì)體內(nèi)靜脈血栓形成的影響；并研究其對(duì)血小板聚集的影響。結(jié)果與模型組相比，楊梅素分散片各劑量組 (140，70，35 mg/kg)均可顯著改善腦水腫、減少過(guò)氧化脂質(zhì)的形成，減少乳酸的聚積，并對(duì)單胺氧化酶有抑制作用；顯著減輕大鼠靜脈血栓重量；顯著抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集。結(jié)論 楊梅素分散片對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性腦缺血具有明顯保護(hù)作用，并有明顯抗血栓形成作用，機(jī)制可能與其抑制脂質(zhì)過(guò)氧化物損害及提高抗氧化酶活性、改善凝血狀態(tài)、抑制血小板依賴性血栓的形成有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】  楊梅素分散片；實(shí)驗(yàn)性腦缺血； 血栓形成； 血小板聚集

楊梅素(myricetin)，又稱楊梅樹(shù)皮素，是一種天然黃酮醇類化合物，為楊梅樹(shù)皮的主要化學(xué)成分，也是廣西藤茶中的主要有效成分之一，并廣泛存在于許多天然植物、水果和茶葉中。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，楊梅素可抑制血小板活化因子（PAF）介導(dǎo)的兔血小板聚集、5-羥色氨（5－HT）釋放及血小板內(nèi)鈣離子濃度升高, 從而起到保護(hù)心血管的作用，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其抗PAF作用比傳統(tǒng)活血化淤中藥紅花的有效成分羥基紅花黃色素Ａ作用強(qiáng)，其作用機(jī)理與PAF受體拮抗劑銀杏總內(nèi)酯相似，可作為一種新的PAF受體拮抗劑［1］。目前,美國(guó)International Food Information Council Foundation （IFIC）已將楊梅素列為功能性食品，并應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、保健品和化妝品中。楊梅素分散片是我們課題組正在研究的新藥制劑，它是用從廣西藤茶中提取得到的楊梅素為主要原料研制而成的。本實(shí)驗(yàn)旨在研究楊梅素分散片對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦缺血的保護(hù)作用及對(duì)體內(nèi)血栓形成的影響，為其新藥開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

　　1  器材

　　1.1  藥物楊梅素分散片，于廣西中醫(yī)學(xué)院制劑教研室制備，批號(hào)060820，實(shí)驗(yàn)時(shí)用蒸餾水研磨配制成不同濃度藥液備用；復(fù)方丹參片，安徽華陀國(guó)藥廠產(chǎn)品，批號(hào)20060512；阿司匹林，湖南新匯制藥有限公司產(chǎn)品，批號(hào)060602；鹽酸腎上腺素注射液，天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào)070401。

　　1.2  試劑超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)試盒，批號(hào)20070315；丙二醛（MDA）測(cè)試盒，批號(hào)20070316；單胺氧化酶（MAO）測(cè)試盒，批號(hào)：20070320；乳酸（LA）測(cè)試盒，批號(hào)20070317；總蛋白（TP）測(cè)試盒，批號(hào)20070319。均為南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。二磷酸腺苷（ADP），上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，批號(hào)20060624。

　　1.3  動(dòng)物KM種小鼠，18～22 g；Wistar種大鼠，體重200～250 g。清潔級(jí)，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK桂2003—0003。動(dòng)物按性別分籠飼養(yǎng)于有空調(diào)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室內(nèi)，室溫(22±1)℃,相對(duì)濕度(60±5)%。自由飲水和喂標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料。

　　1.4  儀器電熱水浴恒溫箱，上海醫(yī)療器械三廠生產(chǎn)；722型光柵分光光度計(jì)，上海第三分析儀器廠生產(chǎn)；MDK-3200型全自動(dòng)血流變測(cè)試分析儀, 重慶麥迪克科技開(kāi)發(fā)有限公司產(chǎn)品；BS631型血小板聚集儀，北京生化儀器廠生產(chǎn)；美國(guó)PE Lambda 12 型紫外分光光度計(jì)。

　　2  方法

　　2.1  楊梅素分散片對(duì)大鼠急性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

　　2.1.1  劑量設(shè)置與分組根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果及臨床常用劑量，楊梅素分散片高、中、低3個(gè)劑量組分別為140，70，35 mg/kg，陽(yáng)性對(duì)照組（復(fù)方丹參片組）為1.2 g/kg，采用與臨床用藥途徑一致的方式灌胃給藥（i.g.）。Wistar大鼠60只，雌雄兼用，隨機(jī)分為6組：假手術(shù)組、模型組、復(fù)方丹參片及楊梅素分散片大、中、小劑量組。

　　2.1.2  模型建立參照文獻(xiàn)方法［2］，大鼠用10％水合氯醛3 ml／kg體重腹腔注射麻醉，頸正中切口，分離、動(dòng)脈夾結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈。缺血1 h后經(jīng)灌胃給藥或溶劑對(duì)照。繼續(xù)缺血1 h后解除動(dòng)脈夾實(shí)施再灌注，血流再通，縫合切口，自由飲食飼養(yǎng)24 h。假手術(shù)組除不結(jié)扎血管外，其余步驟同上。

　　2.1.3  取樣與指標(biāo)測(cè)定［2］大鼠連續(xù)5 d灌胃給藥，1次／d。第5天制造急性腦缺血模型，24 h后開(kāi)顱取腦，以濾紙吸干表面殘血，去除嗅腦、腦干、小腦。各組取右半腦組織標(biāo)本稱腦組織濕重，再將其置于120℃電熱恒溫箱中48 h后稱取干重，按公式計(jì)算腦組織含水量：腦組織含水量(％)=(濕重-干重)／濕重×100％ ；各組余下左半腦組織標(biāo)本分別置于玻璃勻漿器，按質(zhì)量與體積比為1：9比例冰浴下以冰生理鹽水制備成10％的腦組織勻漿，立即放入-30℃冰箱中保存。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)要求，取樣品采用722型光柵分光光度計(jì)和紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定大鼠腦組織中SOD活性，MDA、LA含量及MAO活力。并用血清總蛋白試劑盒測(cè)定腦組織蛋白含量。

　　2.2  楊梅素分散片大鼠體內(nèi)靜脈血栓形成的影響［3］取Wistar大鼠50只，雌雄各半，體重200～250 g，隨機(jī)分為空白對(duì)照組，復(fù)方丹參片組（1.2 g/kg）,楊梅素分散片高、中、低劑量（140，70，35 mg/kg）組，每組10只。各組均灌胃相應(yīng)藥液，1次/d，連續(xù)7 d，末次給藥后1 h，大鼠以10％水合氯醛腹腔注射麻醉，于腹中線切開(kāi)皮膚約3 cm，分離下腔靜脈，于左腎靜脈下方用粗線結(jié)扎下腔靜脈，縫合腹壁。4 h后，重新打開(kāi)腹腔，在結(jié)扎下方2 cm處夾閉管腔，將該段管腔內(nèi)血液吸盡，剖開(kāi)管腔，取出血栓，放在濾紙上，吸干血液，用微量電子天秤稱取血栓濕重(mg)。以血栓重量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，測(cè)定各給藥組對(duì)靜脈血栓形成的影響。

　　2.3  對(duì)體外ADP誘導(dǎo)大鼠血小板聚集的影響［4］取體重200～250gWistar大鼠，用10％水合氯醛3 ml／kg體重腹腔注射麻醉后，剖開(kāi)腹腔，從腹主動(dòng)脈取血，注入盛有3.8%枸椽酸鈉溶液試管中，輕輕搖勻，以1 000 r/min離心5 min，吸取上清液為富血小板血漿（PRP），剩余血繼續(xù)以3 000 r/min離心10 min ，吸取上清液為貧血小板血漿（PPP）。將BS631型血小板聚集儀打開(kāi)，預(yù)熱30 min后，用PRP調(diào)零（0%），用PPP調(diào)幅度（100%）。測(cè)定時(shí)對(duì)照管取PRP 0.4 ml及生理鹽水20 μl，給藥管取0.4 ml PRP及藥液20 μl（配成不同濃度）放入比濁管中，在37℃恒溫及1 300 r/min攪拌條件下加入ADP 50 μl(50 μg/ml)，用自動(dòng)平衡儀以20 mm/min紙速記錄對(duì)照管和給藥管血小板聚集曲線，根椐所記錄的曲線計(jì)算血小板聚集百分?jǐn)?shù)（%）。

　　2.4  統(tǒng)計(jì)方法采用PEMS3.1統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示，采用t檢驗(yàn)作組間比較差異顯著性。

　3  結(jié)果

　　3.1  楊梅素分散片對(duì)大鼠急性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

　　3.1.1  對(duì)腦缺血再灌注損傷后腦組織含水量的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，模型組腦含水量明顯增加(P<0．05)，表明腦缺血再灌注有腦水腫的發(fā)生。楊梅素分散片各劑量組均能明顯降低腦組織含水量，與模型組相比差異顯著(P<0．01或P<0．05)。結(jié)果見(jiàn)表1。

　　表1  楊梅素分散片對(duì)腦缺血再灌注損傷后腦組織含水量的影響（略）

　　與假手術(shù)組比較，#P<0.05;與模型組比較，*P<0.05;**P<0.01

　　3.1.2  對(duì)腦缺血再灌注損傷腦組織SOD活性及MDA含量的影響與假手術(shù)組比較，模型組腦組織SOD活性明顯降低，MDA含量明顯增加(P<0．05)，表明腦缺血再灌注伴有腦組織自由基的聚積以及抗氧化酶活性的降低。與模型組比較，楊梅素分散片各劑量組均能明顯升高腦組織中SOD活性，降低MDA含量，提示楊梅素分散片具有抗氧化作用。結(jié)果見(jiàn)表2。

　　表2  楊梅素分散片對(duì)腦缺血再灌注損傷后腦組織SOD活性及MDA含量的影響（略）

　　與假手術(shù)組比較，#P<0.05; 與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

　　3.1.3  對(duì)腦缺血再灌注損傷腦組織LA含量及MAO活力的影響與假手術(shù)組相比，模型組腦組織LA含量及MAO活力有顯著增加(P<0.05)，表明腦缺血再灌注時(shí)腦組織伴有LA 聚積并可能由于大量過(guò)氧化氫(H2O2)的產(chǎn)生增強(qiáng)了MAO的活性。楊梅素分散片各劑量組均能顯著降低LA 含量及MAO活力，與模型組相比有顯著差異(P<0．05)。結(jié)果見(jiàn)表3。

　　表3  楊梅素分散片對(duì)腦缺血再灌注損傷后腦組織MAO活性和LA含量的影響（略）

　　與假手術(shù)組比較，#P<0.05;與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

　　3.2  楊梅素分散片對(duì)大鼠體內(nèi)靜脈血栓形成的影響與空白對(duì)照組比較, 楊梅素分散片各劑量組和復(fù)方丹參片組能明顯減少大鼠體內(nèi)靜脈血栓濕重, 提示楊梅素分散片具有抗大鼠體內(nèi)靜脈血栓形成作用。結(jié)果見(jiàn)表4。

　　表4  楊梅素分散片對(duì)大鼠體內(nèi)靜脈血栓形成的影響（略）

　　與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；n=10

　　3.3  對(duì)體外ADP誘導(dǎo)大鼠血小板聚集的影響與空白對(duì)照組比較, 楊梅素分散片高、中、低劑量組和復(fù)方丹參片組均能明顯抑制大鼠血小板聚集率，結(jié)果見(jiàn)表5。

　　表5  楊梅素分散片對(duì)大鼠血小板聚集的影響（略）

　　與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01;***P<0.001；n=10

　　4  討論

　　腦缺血是較常見(jiàn)的腦血管系統(tǒng)病癥，涉及多個(gè)病理生理環(huán)節(jié)。恢復(fù)腦缺血后血流供應(yīng)是臨床治療重要環(huán)節(jié)。大量實(shí)驗(yàn)研究表明［5，6］，缺血后再灌注可產(chǎn)生大量自由基，破壞組織結(jié)構(gòu)而加重組織損傷，因此，防治腦缺血再灌注損傷的重要措施之一就是抗自由基對(duì)腦組織的毒害作用。此外，當(dāng)腦缺血發(fā)作時(shí)，腦細(xì)胞生物氧化功能發(fā)生異常，產(chǎn)生大量自由基，生成大量的脂質(zhì)過(guò)氧化物，其中最主要的是MDA，因此MDA含量可反映其損傷程度；NO本身也是一種自由基，有研究表明，適量的NO對(duì)腦有保護(hù)作用；但腦缺血后期或再灌注時(shí)NO的增高則會(huì)擴(kuò)大缺血面積,加重腦水腫及神經(jīng)細(xì)胞的損傷。當(dāng)腦缺血損傷時(shí)，MDA和NO參與了損傷過(guò)程,而SOD作為體內(nèi)重要的氧自由基清除劑,在保護(hù)細(xì)胞不受毒性自由基的損傷方面發(fā)揮著重要的作用。因此SOD活性的大小可以反映機(jī)體抗損傷及抑制細(xì)胞凋亡的程度。

　　本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，腦缺血再灌注可導(dǎo)致內(nèi)源性抗氧化酶系統(tǒng)功能降低而過(guò)氧化脂質(zhì)增加，產(chǎn)生嚴(yán)重的腦水腫，并伴有嚴(yán)重的能量代謝障礙，腦組織中MAO活性增加，LA大量聚積，造成腦組織的損傷，明顯影響大腦的正常功能。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，楊梅素分散片可提高SOD活性,減少M(fèi)DA含量,顯著改善急性腦缺血大鼠的腦水腫、減少過(guò)氧化脂質(zhì)的形成，減少乳酸的聚積，并對(duì)單胺氧化酶有抑制作用，從而減輕了氧自由基對(duì)腦組織的毒害，證明本藥物具有清除自由基及抗脂質(zhì)過(guò)氧化的作用,對(duì)大鼠急性腦缺血及再灌注損傷確有保護(hù)作用。

　　血栓形成是腦缺血性疾病的主要致病因素之一，是腦卒中、冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化等致殘和致死率高的心腦血管疾病的主要病理學(xué)基礎(chǔ)。血小板激活在腦血栓形成中起關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)選用ADP為誘導(dǎo)劑,觀察了楊梅素分散片對(duì)血小板聚集功能的影響，同時(shí)還探討了該藥物對(duì)大鼠體內(nèi)靜脈血栓形成的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 楊梅素分散片各劑量均能抑制以上ADP誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的血小板聚集，明顯抑制大鼠體內(nèi)血栓的形成，提示楊梅素分散片對(duì)大鼠局部腦缺血的保護(hù)作用與其抑制血小板聚集、干擾血栓的形成有關(guān)。該研究結(jié)果為楊梅素分散片用于治療缺血性腦血管病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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