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【摘要】：[目的]考察利用聚酰胺分離純化巫山淫(Epimedium wushanese T.SYing)羊藿中淫羊藿苷的工藝條件和參數(shù)。[方法]采用聚酰胺柱色譜法,以10%～40%乙醇水溶液進(jìn)行梯度洗脫,分離富集淫羊藿苷,并配以HPLC進(jìn)行同步監(jiān)控。[結(jié)果]不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇洗脫液對(duì)淫羊藿苷的洗脫能力不同,淫羊藿苷在30%乙醇水溶液中得到了分離富集,含量可達(dá)17.22%,收率為95.97%。[結(jié)論]采用聚酰胺柱色譜法能有效分離巫山淫羊藿中淫羊藿苷,且操作簡(jiǎn)單,重復(fù)性好。

【關(guān)鍵詞】： 巫山淫羊藿淫羊藿苷 聚酰胺色譜法

     淫羊藿為小檗科淫羊藿屬植物，分為淫羊藿(Epimedium brevicomum Maxim．)、箭葉淫羊藿[Epimedium sagittatum (Sieb．et Zucc．)Maxim．]、柔毛淫羊藿(Epimedium pubescens Maxim．)，巫山淫羊藿(Epimedium wushaense T．S．Ying)和朝鮮淫羊藿(Epimedium koreanum Nakai)，其干燥地上部分均為原料藥材。淫羊藿味辛、甘，性溫，歸肝、腎經(jīng)，可補(bǔ)。腎陽(yáng)，強(qiáng)筋骨，祛風(fēng)濕，用于陽(yáng)痿遺精、筋骨痿軟、風(fēng)濕痹痛、麻木拘攣、更年期高血壓等癥。淫羊藿的主要有效成分是淫羊藿黃酮(淫羊藿苷、淫羊藿次苷)，其總黃酮具有增加心腦血管血流量、促進(jìn)造血、抗腫瘤、抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫力和骨代謝等功能 一 。淫羊藿總黃酮的提取與分離前人有所研究，但其重要成分淫羊藿苷的分離純化報(bào)道較少，且多采用硅膠柱色譜¨ 和多級(jí)逆流萃取 。聚酰胺是分離純化黃酮類化合物非常有效的填料，且價(jià)格低廉，適宜工業(yè)化生產(chǎn)。為此，筆者采用聚酰胺色譜法分離純化淫羊藿中的淫羊藿苷，并優(yōu)化其工藝條件和參數(shù)，為更好地提取與分離淫羊藿中淫羊藿總黃酮提供新的途徑。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 主要儀器。Agilent．1100高效液相色譜儀(自動(dòng)進(jìn)樣)；Mettler Toledo AL204型電子天平；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn))；DZF-250電熱真空干燥箱(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司生產(chǎn))；中壓色譜柱(2．5 cm x70．0 am)；HL·2B 恒流泵(上海青浦滬西儀器廠生產(chǎn))。

1．1．2 主要試劑。淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品(購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所)；聚酰胺(60—100目，臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠生產(chǎn))；乙醇(分析純)；乙腈(色譜純)；巫山淫羊藿[購(gòu)于四川，經(jīng)遵義醫(yī)學(xué)院楊建文副主任藥師鑒定為巫山淫羊藿 (Epimedium Wlsharlel~e T．S．Ying)]。

1．2 方法

1．2．1 聚酰胺的預(yù)處理及回收。聚酰胺于95％ 的優(yōu)質(zhì)工業(yè)乙醇中煮沸30 min，過(guò)濾，再次置于95％ 的優(yōu)質(zhì)工業(yè)乙醇中煮沸，重復(fù)3次。使用過(guò)的聚酰胺用5％ 的氫氧化鈉溶液浸泡4 h，水洗至中性。

1．2．2 淫羊藿苷的提取。稱取淫羊藿枝葉，剪碎，加入6o％乙醇回流提取3次，每次2 h，過(guò)濾，回收乙醇得黃色浸膏。浸膏在真空干燥箱中60℃ 下干燥至恒重，經(jīng)HPLC測(cè)定淫羊藿苷的含量為3．97％。

1．2．3 淫羊藿苷的分離純化。取經(jīng)處理過(guò)的聚酰胺，水浸潤(rùn)后濕法裝柱。精密稱取淫羊藿提取物1．496 1 g，少量熱水溶解后加入到色譜柱中，并被聚酰胺吸附。調(diào)整恒流泵使柱流速為1 d／s，采用水和10％ 、20％ 、30％ 、40％ 乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫。分段收集從10％ 乙醇開(kāi)始洗脫的洗脫液，每份1 個(gè)柱體積，HPLC在線監(jiān)測(cè)化學(xué)成分流出情況，根據(jù)化學(xué)成分含量的變化改變洗脫液的濃度。收集含有淫羊藿苷的洗脫液，經(jīng)0．45 m過(guò)濾膜過(guò)濾后直接進(jìn)行檢測(cè)，相同部分進(jìn)行合并，濃縮，60℃ 減壓干燥，即得淫羊藿苷樣品。

1．2．4 淫羊藿苷含量的測(cè)定。

1．2．4．1 色譜條件。色譜柱：Agilent Eclipse XDB—C18色譜柱(250 mm×4．6 mm，5 lxm)；流動(dòng)相，乙腈一水(30：70)；檢測(cè)波長(zhǎng)，270 am；流速，1．0 ml／min。

1．2．4．2 對(duì)照品溶液制備。精密稱取淫羊藿苷對(duì)照品5．0 mg，置于50 Hll量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，即得。

1．2．4．3 供試品溶液制備。精密稱取淫羊藿苷樣品0．281 0 g，置于100 ml量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，即得。

1．2．4．4 線性關(guān)系考察。設(shè)淫羊藿苷對(duì)照品溶液的進(jìn)樣量依次為1、2,4、8、l2 1，按“1．2．4．1”的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜峰，以峰面積Y對(duì)質(zhì)量數(shù) ( g)進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得回歸方程。

1．2．4．5 精密度試驗(yàn)。精密吸取對(duì)照品溶液8 ，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄淫羊藿苷的峰面積和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(no)。

1．2．4．6 穩(wěn)定性試驗(yàn)。精密吸取淫羊藿苷樣品溶液1 ，分別于0、2、4、6、8、10 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積和RSD。 2 結(jié)果與分析

2．1 洗脫劑的選擇前期試驗(yàn)以鹽酸一鎂粉為顯色劑檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在用不同濃度乙醇梯度洗脫淫羊藿提取物時(shí)，濃度大于40％以后基本已經(jīng)沒(méi)有黃酮成分流出。采用HPLC考察淫羊藿提取物中的黃酮成分組成情況，結(jié)果見(jiàn)色譜圖1，淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見(jiàn)圖2。由圖1、2可知，淫羊藿苷為提取總黃酮中極性最低的一個(gè)。因此，采用的洗脫劑為水和10％一4|D％ 的乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫。

2．2 線性關(guān)系考察結(jié)果回歸方程為：y=973．2x一4．1，r= 0．999 8，線性范圍為：0．096～1．152 Ixgo 2．3 精密度試驗(yàn)結(jié)果淫羊藿苷峰面積的平均值為751， RSD=0．55％，表明儀器的精確度良好。

2．4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果淫羊藿苷峰面積平均值為501，RSD = O．9o％，表明供試品溶液在10 h內(nèi)基本穩(wěn)定，測(cè)量結(jié)果無(wú)明顯變化。

2．5 不同濃度乙醇洗脫液中淫羊藿苷的含量測(cè)定結(jié)果 由圖3～5可知，收集10％ 乙醇洗脫液6個(gè)柱體積，20％ 乙醇洗脫液7個(gè)柱體積，30％乙醇洗脫液l1個(gè)柱體積；40％ 乙醇洗脫液中已無(wú)黃酮成分，不收集�？梢�(jiàn)，淫羊藿苷(出峰時(shí)間 7．096 min)主要富集在30％ 的醇洗脫液中。

2．6 淫羊藿苷含量和總收率的測(cè)定由表1可知，分離純化后淫羊藿苷的含量為l7．22％ ，收率為95．97％。

3 結(jié)論與討論

采用聚酰胺分離純化巫山淫羊藿中的淫羊藿苷，用水、 10％ ～40％ 乙醇水溶液進(jìn)行梯度洗脫，10％ 乙醇洗脫液6個(gè)柱體積，20％ 乙醇洗脫液7個(gè)柱體積以上的用量可有效除去雜質(zhì)，30％ 乙醇洗脫液l1個(gè)柱體積用量能富集絕大部分淫羊藿苷。該方法操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，可用于生產(chǎn)。

聚酰胺能與不同黃酮類化合物形成強(qiáng)弱不等的氫鍵，即 “氫鍵吸附”學(xué)說(shuō)，是分離黃酮最有效和最常用的填料之一。

該研究結(jié)果表明，水和10％ 、20％ 乙醇能很好地將非淫羊藿苷的黃酮部分除去，此時(shí)，淫羊藿苷還沒(méi)有流出；30％乙醇能得到絕大部分淫羊藿苷，計(jì)算得出該部分淫羊藿苷的含量為 17．22％ ，收率達(dá)到95．97％ ，說(shuō)明淫羊藿苷得到了很好的分離和富聚，而且沒(méi)有因?yàn)榫埘０返奈�附造成很大的損失。